エンテロコッカス・フェカリスHMGを標的とする

Communications Biology volume 6、記事番号: 360 (2023) この記事を引用

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グラム陽性病原菌におけるメバロン酸経路の律速酵素である HMG-CoA レダクターゼ (HMGR) は、新規抗生物質開発の魅力的な標的です。 この研究では、エンテロコッカス フェカリス由来の HMGR (efHMGR) のアポ型およびリガンド型の結晶構造を報告し、この酵素のいくつかのユニークな特徴を強調します。 スタチンはナノモルの親和性でヒトの酵素を阻害しますが、細菌の HMGR ホモログに対してはあまり効果がありません。 我々はまた、ハイスループットの in vitro スクリーニングによって同定された efHMGR 酵素の強力な競合阻害剤 (Chembridge2 ID 7828315 または化合物 315) も報告します。 315と複合体を形成したefHMGRのX線結晶構造は1.27Åの分解能で決定され、この阻害剤がメバロン酸結合部位を占有し、細菌相同体間で保存されているいくつかの重要な活性部位残基と相互作用することが明らかになった。 重要なのは、315 はヒト HMGR を阻害しないことです。 細菌性 HMG-CoA レダクターゼの選択的非スタチン阻害剤の我々の同定は、リードの最適化と新規抗菌薬候補の開発に役立つでしょう。

病原菌の抗生物質耐性は、世界中で人間の健康に対する差し迫った脅威となっています。 近年、黄色ブドウ球菌を含むいくつかのグラム陽性菌が、腸球菌からの側方遺伝子伝達事象によって複数の抗生物質に対する耐性を獲得しており 1,2 、臨床管理が困難になっています。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）とバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の蔓延は、これらの抗生物質耐性菌によって引き起こされる感染症が高い罹患率と死亡率を伴うため、公衆衛生上の大きな懸念事項となっています3。 現在市場にある抗生物質や承認パイプラインは、古いクラスの変異体であるか、同じ分子経路を標的とするため、同じ耐性メカニズムの餌食となります。 この抵抗を克服するには、代替の分子標的を同定することが必要です。

メバロン酸経路は、このような新規抗菌薬の設計にとって魅力的な標的です。 これは、3当量のアセチルCoAと一連のさまざまな補因子を摂取して、メバロン酸中間体を介してイソペンテニル二リン酸を生成する一連の酵素で構成されています。 イソペンテニル二リン酸 (IPP) は、生物学的スペクトル全体にわたる多数の代謝機能に関与するイソプレノイドの中心的な代謝成分です 4,5。 細菌では、IPP は、ペプチドグリカン細胞壁の生合成に関与するウンデカプレノール 6、電子伝達鎖のユビキノンおよびメナキノン、黄色ブドウ球菌のスタフィロキサンチンなどのカロテノイドを生成します 7。

黄色ブドウ球菌8、エンテロコッカス・フェカリス、肺炎連鎖球菌9などの低G+Cグラム陽性菌の生存にはメバロン酸経路が必要であるため、新規抗生物質開発の標的候補としてこの経路に関するいくつかの研究が行われている。 すべてのグラム陰性菌およびその他のグラム陽性菌がメバロン酸経路を介して IPP を生成するわけではないことに注意してください。 大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター ピロリ、枯草菌などのいくつかの細菌種は、非メバロン酸 1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸/2-C-メチル-D-エリスリトール 4-リン酸（DOXP/MEP）経路を利用しています10。 11. したがって、メバロン酸経路の阻害剤は、正常な宿主腸内細菌叢に影響を与えることなく、この経路に依存する主要な病原性細菌を含む低G+Cグラム陽性球菌を特異的に標的とすることになり、このアプローチはヒトにとって重要であると認識されている。健康と癒し12．

HMG-CoA レダクターゼ (HMGR) は、メバロン酸経路の律速段階である (S)-HMG-CoA から (R)-メバロン酸への 4 電子還元を触媒します 13。 HMGR は、病原性細菌の生存に必須のメバロン酸経路酵素の 1 つであることも示されており、したがって阻害剤設計の魅力的な標的となっています 14。 配列アラインメントと 3D 構造により、HMGR の進化的に分岐した 2 つのクラスが明らかになり、真核生物およびほとんどの古細菌相同体はクラス I 酵素として分類され、細菌および少数の古細菌相同体はクラス II 酵素として分類されます。 さらに、コレステロール低下薬スタチンによる阻害の 104 倍の違いに反映される、ヒトと細菌のホモログ間の活性部位構造の実質的な違いにより、細菌の酵素に特異的な阻害剤の設計が可能になります 14,15。

この追求において、我々は、アポ型 (Ref-apo) の標的 HMG-CoA レダクターゼ、およびリガンド HMG-CoA、メバロン酸および補因子 NADP+ との複合体 (Ref-ternary) の結晶構造を報告します。病原性細菌 E.フェカリス。 さらに、この酵素に対する小分子阻害剤を探すために大規模な in vitro スクリーニングが実施され、低マイクロモル範囲の IC50 を持つリード化合物が同定されました。 最後に、E. faecalis HMG-CoA レダクターゼ酵素 (efHMGR) に結合したこの阻害剤 (Chembridge2 ID 7828315) の結晶構造 (Ref-315) が解明され、阻害の分子機構が詳述され、将来の構造ベースの基礎が確立されました。ドラッグデザインの研究。

メバロン酸経路の最初の 3 段階には、アセトアセチル CoA チオラーゼ、HMG-CoA シンターゼ、および HMG-CoA レダクターゼという酵素が関与します。 アセトアセチル-CoA チオラーゼは、2 つのアセチル-CoA 分子の縮合を触媒してアセトアセチル-CoA を生成します。 HMG-CoA シンターゼは、アセチル CoA とアセトアセチル CoA の縮合を触媒して HMG-CoA を形成します。 次に、HMG-CoA レダクターゼは、HMG-CoA からメバロン酸への変換を触媒します 14。 順反応は NADPH および HMG-CoA によって駆動され、逆反応は CoA-SH、メバロン酸および NADP+ によって駆動されます。 E. faecalis の mvaE 遺伝子産物は、2 つの異なる触媒機能を保有する融合タンパク質をコードします 16。 N 末端ドメイン (1-378) にはアセトアセチル CoA チオラーゼ活性があり、C 末端ドメインには HMG-CoA レダクターゼ活性が含まれています。 私たちの研究のために、この C 末端ドメイン (残基 381 ～ 803) は、Purdue17 の Victor Rodwell 教授の研究室で全長遺伝子からクローン化されました。

アポ型およびリガンド結合型の大腸菌フェカリス由来のHMG-CoAレダクターゼ(efHMGR)を発現させ、精製し、結晶化させた(方法)。 アポおよびリガンド結合酵素の結晶構造は、それぞれ 2.25 Å および 2.27 Å まで解析されました。 得られた構造は、以前に発表された細菌ホモログ 18、19、20、21 の全体的な構造に従います。 簡単に説明すると、efHMGR は、各モノマーの成分から構成される 2 つの活性部位を有する偏性で絡み合った二量体です (図 1a)。 異なるモノマー/鎖に由来する残基を区別するために、鎖 ID が残基の隣の括弧内に書かれています。 たとえば、Asn-184 (A) は、残基 Asn-184 が鎖/モノマー A に由来することを意味します。各モノマーは 3 つのドメインで構成されます。1 つは HMG-CoA に結合する大きなドメイン (残基 1 ～ 108 および 212 ～ 370) です。 NADP+/NADPHと相互作用する非古典的ロスマンヌクレオチド結合ドメインと、最後に最後の53番目を構成するC末端フラップドメイン（残基371～423）で構成される小さなドメイン（残基109～211）。モノマーの残基（図1b）。 クラス II 細菌ホモログ 14 では、フラップ ドメインは持続的な 3 らせんバンドル構造を持ち、反応が進行するにつれてタンパク質本体と動的に相互作用します 18,20。

a apo efHMGR 二量体構造: 2 つの単量体が複雑に相互作用して、それぞれ緑色と青色に着色された生物学的に活性な二量体を形成します。 交換される N 末端ドメインは赤い四角で示されます。 b リガンド結合した efHMGR 二量体では、フラップ ドメイン (オレンジ色) は、HMG-CoA と NADP+ (青と黄色の棒で表されます) の結合時に閉じます。 HMG-CoA は主に 1 つのモノマーの大きなドメイン (緑) と相互作用し、NADP+ は他のモノマーの小さなドメイン (青) と相互作用します。 c efHMGR に固有の ENQISX3VP ループは、クロスオーバー ポイントでのさまざまな相互作用に関与します。 相互作用する残基 (Gln-39、Phe-40、Asn-42、Ala-44、Leu-45、Gln-57、Ile-58、Ser-59、Glu-60、Glu-62、および Lys-332) が表示されます。スティックで。 水素結合は赤い破線で示され、距離はÅで示されます。 d 漫画表示で示されている pmHMGR (緑) および DaHMGR (赤) の ENVIG ループは、Met-44、Ala-47、および Val-54 などの他の疎水性残基とともにこのループの前にプロリン残基が存在することにより、完全なドメインの形成が妨げられることを示唆しています。スワップ。 二量体パートナーはシアンで示されています。 参考としてefHMGR（グレー）の「ENQISループ」を示します。 e efHMGRとS. pneumoniae、S. aureus、P. mevalonii、Listeria monocytogenes、Delftia Acidovorans、E. faecium、E. hiraeのクラスII HMGR配列との多重配列アラインメントは、ENQISループ（赤いボックス内）がエンテロコッカス。

両方の結晶形 (Ref-apo および Ref-ternary) の非対称単位は、二量体 (AB および CD) の二量体として配置された四量体から構成されますが、二量体-二量体界面は保存されません。 アポ酵素の構造では、二量体間の接触は主に、結晶化状態で酢酸カルシウムによって供与されるカルシウムイオンによって媒介されます。 リガンド結合複合体では、フラップドメインが関与する二量体-二量体界面で、異なるセットの結晶誘導接触が観察されます。 二量体-二量体界面は非常に小さく、異なる形態間で保存されていないため、おそらく結晶充填の結果であり、生物学的関連性はありません（補足図1および補足注記1）。

ドメイン交換は、モノマー間で類似の構造要素を交換し、高次の集合を引き起こすオリゴマー形成のメカニズムです。 交換の範囲は、単一の二次構造要素から三次ドメイン全体に及ぶ可能性があります。 ドメイン交換の生物学的役割は、タンパク質の機能を調節するメカニズムと、安定したタンパク質複合体を形成するための進化戦略を提供することである可能性があります 22,23。 HMG-CoA レダクターゼは、N 末端サブドメイン (残基 1 ～ 65) のドメイン交換の程度が異なる酵素を備え、種を超えて二量体またはより高次のオリゴマー形態 19 で存在します 15、19、21。 ヒト 24 およびアーキアル 25 ホモログの公開されたクラス I 構造では、サブドメイン全体が隣接するモノマーの C 末端ドメインに対して折りたたまれ、交差し、主に相互作用します。 しかし、これまでに解明されたすべてのクラス II 原核生物レダクターゼでは、二量体化要素 ENVXGX3I/L/VP (残基 46 ～ 61) の周囲の 16 残基のみが交換され、残りの N 末端サブドメインはそれ自体で倍加して相互作用します。同じモノマーの C 末端ドメインを持つ 21,25,26。 E.フェカリス由来のHMGRは例外であることがわかっています。 それ以外は古典的なクラス II HMGR ですが、その N 末端ドメイン全体 (残基 1 ～ 65) はヒンジ領域 (残基 42 ～ 45) の周りで完全なドメイン交換を受け、その二量体パートナーのメインドメインと相互作用します (図 1a、 c）そうすることでクラスIホモログに似ています（補足図2）。

いくつかの要因がタンパク質のドメイン交換の程度に影響を与えます。これには、プロリン残基の存在、柔軟性、およびドメインが交換されるヒンジ領域の長さが含まれます 27。 我々のデータは、隣接する単量体とβシートを形成するefHMGRのαCとβAの間の「二量体化要素」がドメイン交換に重要な役割を担っていることを示唆している。 独特なことに、前述の要素には、バリンとグリシンの代わりにグルタミンとセリン（下線）が置換された配列ENQ57IS59X3VPが含まれており、それ以外の場合は他のほとんどの細菌ホモログに存在します（図1e）。 ここで報告された 3 つの efHMGR 構造はすべて、Gln-57、Ser-59 (ENQIS ループ内)、および Glu-60 (残基 X) がいくつかの相互作用を行い、このクロスオーバーを安定化させることを示唆しています (補足注 2)。 一方のモノマーの Phe-40、Asn-42、Ala-44、Leu-45、Gln-57、Ser-59、Glu-60、Glu-62 ともう一方のモノマーの Lys-332 間の水素結合 (H 結合) 相互作用（二量体ペアの）単量体は、クロスオーバーポイント付近でドメイン交換を安定させます（図1c）。

他の原核生物 HMGR 酵素では、シュードモナス メバロニ (pmHMGR、PDB: 4i64)20、肺炎球菌 (SpHMGR、PDB: 5wpj)18、デルフティア アシドボランス (DaHMGR、PDB: 6eeu)26、およびバークホルデリア セノセパシア (BcHMGR、PDB: 6p7k)19 に由来します。 、ENQISシーケンスは、そのような相互作用を行わないENVXGシーケンスによって置き換えられます（図1dおよび補足注2）。

efHMGR 構造におけるドメイン交換のこの違いは、融合アセトアセチル CoA チオラーゼ ドメインとの相互作用において機能的重要性を有する可能性があります。 これに関連して、efHMGR は、酵素の適時の分解に関与する大きな N 末端膜貫通ドメインも有するクラス I ヒト HMGR に似ています 28。 efHMGR の場合、二量体の安定性がスワップの機能的な役割である可能性があります。 E. faeciumとE. hiraeのホモログはどちらも、単一のポリペプチドにアセトアセチル-CoAチオラーゼおよびレダクターゼ活性を備えた融合タンパク質をコードしており、「ENQI/VS」配列も表示します（図1e）。

efHMGR の二量体界面に存在する活性部位は、分子表面に沿って V 字型を形成する開いた溝です。 V の一方の腕には HMG-CoA が保持され、もう一方の腕には NADP+ が保持されます。 三元複合体構造は、HMG-CoAが一方のモノマーの大きなドメインに結合し、NADP+がもう一方のモノマーの小さなドメインに結合することを示しています（図1bおよび2a）。 V の点では、2 つのモノマーがリガンドをより深いポケットに集め、6 炭素の HMG またはメバロン酸を結合します。 この配置により、水素化物移動のために HMG-CoA チオエステル カルボニル炭素が NADPH のニコチンアミド環の C4 原子の近くに配置されます。 efHMGR 活性部位と他の公表されている原核生物 HMGR 酵素 (rms 偏差 ~0.1 ～ 0.3 Å) との比較は、これが高度に保存された活性部位であり、リガンドと酵素残基の間に同様の相互作用が観察されることを示唆しています。 Glu-86、Lys-263、および Asp-279 の 3 つの触媒はチオエステルのカルボニル酸素の周囲に配置され、中間体の発生中の負電荷を安定化し、メブアルデヒドからメバロン酸への最終変換のための水素を供給する準備ができています 29。 酵素とリガンド、HMG-CoA、メバロン酸、および NADP + の間の相互作用については、補足セクションで詳しく説明します (補足図 3a-c)。

NADP+とHMG-CoAが活性部位に結合したefHMGRの静電表面電位マップ。 HMG-CoA (緑色) と NADP+ (黄色) は両方とも棒で表されます。 b Tyr-146、Ser-148、およびArg-152残基は、NADP+の2'-リボース-リン酸基の酸素原子と相互作用するefHMGRの小ドメインに存在する分子決定基を表します。 皮弁に由来する Gln-410 も NADP+ と相互作用します。 NADP+ 分子は、1.0σ の 2Fo-Fc 差密度に包まれています。 水素結合相互作用は赤い破線で表され、距離はÅで示されます。 c 肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および大便連鎖球菌のクラス II HMGR は、補因子として NADPH を利用します。 補因子の特異性を決定する残基 (アスタリスクでマーク) は、efHMGR を含むこれらの細菌酵素で保存されています。 NADH を利用する P. mevalonii HMGR は、分子決定基として Asp-146、Leu-148、および Leu-152 を持っています。

フラップ ドメイン (残基 371 ～ 421) はリガンド結合時に閉じて、活性部位を覆い、触媒作用のある His-376 を所定の位置に配置します。 efHMGR のフラップ ドメインに先行するヒンジ領域 (残基 368 ～ 370) は、リガンド結合時に実質的な構造変化を受けます。 アポ酵素である Glu-370 では、ヒンジの最後の残基が部分的に乱れています。 ただし、リガンド結合時に、Glu-370 の側鎖カルボキシル基が Arg-365 のグアニジニウム基と塩橋相互作用を形成するように、Glu-370 の主鎖は再配向します (ΔΦ = −78.1° ΔΨ = −12.9 °)。 Glu-370 はさらに、水を介した水素結合相互作用を介して HMG-CoA の二リン酸部分に結合します。 Arg-365 のグアニジノ基は、水分子を介して HMG-CoA のパントテン部分のカルボニル酸素と相互作用します。 さらに、Glu-370は、水分子を介して、フラップの最初のヘリックスに存在する後続の残基、Gly-371およびGly-375と相互作用します（補足図4）。 Arg-365 と Glu-370 の間の塩橋相互作用は efHMGR に特有であり、フラップが順序付けられるたびに観察され、これがフラップ ドメインの閉鎖に重要である可能性があることを示唆しています。 これらの残基は、pmHMGR には存在しますが、閉じたフラップ構造ではそのような相互作用には関与しません (PDB: 1qax、4i4b)。

efHMGR の三元複合体構造では、非対称ユニット内の各二量体 (AB および CD) に 2 つの活性部位があり、合計 4 つあります。 NADP+ はすべての活性部位に存在し、HMG-CoA は 1 つのみに存在し、HMG-CoA と NADP+ の組み合わせが非活性なリガンドの組み合わせを形成します。 メバロン酸と一致する密度は、活性部位の 1 つでも見られます。 HMG-CoA は放射線損傷によりメバロン酸に自発的に還元されることが知られているため、これは珍しいことではありません (PDB: 1r31)20。

NADH は ATP を生成する酸化プロセスの補酵素として機能し、NADPH は還元生合成反応の補酵素として機能します。 NADH と比較すると、NADPH は ADP リボース部分の 2' ヒドロキシル基にリン酸基を保持しており、これにより酸化還元剤の 2 つのプールが分離されます。 古典的なロスマンジヌクレオチド結合ドメインを含む複数のデヒドロゲナーゼの分析は、GXGXXG/A フィンガープリントを含むループが、NADH/NADPH30 のアデニン-リボース部分への酵素の結合を促進することを示唆しています。 ただし、NADPH 対 NADH の選択は、このコンセンサス配列の周囲の残基に依存すると思われ、デヒドロゲナーゼの異なるファミリー間で異なります。

NADH または NADPH に対する HMGR 酵素の特異性は、2 つのクラス間で異なります。 クラス I 真核生物ホモログは NADPH のみを利用しますが、クラス II 原核生物ホモログは NADH または NADPH のいずれかを利用できます。 Archaeoglobus fulgidus のクラス II レダクターゼは両方の補因子を利用できます 31 が、pmHMGR は NADH32 に対して高度に選択的であり、S. pneumoniae、S. aureus、および E. faecalis からの酵素は NADPH16 に対して特異的です。 実際、NADH を使用した場合、efHMGR は活性を示さず、NADPH の 10 倍過剰な NADH では反応を阻害できませんでした 16。

NADH に特異的な pmHMGR のようなホモログは、2' および 3' と相互作用する小さなドメイン内の短いアルファ ヘリックス (αF ヘリックス) 上に、負に帯電したアミノ酸、不変のアスパラギン酸残基 (Asp-146) を持っています。 -アデニン-リボース部分の水酸基。 Friesen ら 33 は、Asp-146 を Ala に変異させ、隣接する Leu-148 の代わりに正に荷電した残基 (Arg) を導入することにより、NADPH に対する pmHMGR 酵素の相対的特異性を改善することに成功しました。 これらの観察により、彼らは、この位置の小さな残基がリン酸部分のための余分な余地を提供し、近くの正に帯電した残基がリン酸の負電荷を中和するであろうという仮説を立てました33。

それぞれの NAD/P 補因子に結合した pmHMGR 酵素 (PDB: 1qax) を efHMGR 上に構造的に重ね合わせると、リン酸のためのスペースを作るために 146 位の小さな側鎖を選択するのではなく、大きくてかさばるチロシン残基 (Tyr- 146) が efHMGR で選択されました。 これにより、アデニン-リボース-リン酸がP. mevaloniiの構造と比較して90°近くの角度で持ち上げられます。 Tyr-146 (D) の側鎖ヒドロキシル基は、アデニン-リボース-リン酸酸素 (O2X) に水素結合します。 efHMGR の次の残基は Pro-147 (D) で、α ヘリックスに屈曲が導入され、それによって次の残基 Ser-148 (D) がアデニン-リボース-リン酸酸素 (O3X) の水素結合距離に入ります。 (図2b)。 pmHMGR 内の 2 つの同等の残基は Gln-147 と Leu-148 であり、どちらもリボース ヒドロキシルと相互作用できません。 最後の変化は P. mevalonii の Leu-152 残基で、VDW をアデニン塩基 (3.6 Å) と接触させ、E. faecalis ではアルギニン残基 (Arg-152) に置換されます。 Arg-152 (D) はアデニン塩基 (3.5 Å) とスタッキング相互作用を形成し、NADP+ のリボース-リン酸酸素 (O3X) とも水素結合を形成します (図 2b)。 これらの4つの変化（D146Y、Q147P、L148S、およびL152R）は、ブドウ球菌、腸球菌および連鎖球菌のHMGRアラインメント配列で保存されています（図2c）。

以前に発表された SpHMGR の構造 (PDB: 5wpj)18 は、NADPH のリボース - ホスホリル酸素と類似の Ser 残基および Arg 残基との間の相互作用を報告し、Tyr-144 (efHMGR の Tyr-146 に類似) がアデノシン部分を強制的に結合させることを示唆しました。リボース - ホスホリル酸素が Ser-146 (efHMGR の Ser-148 に類似) と H 結合できるようにします 18。 私たちのefHMGR結晶構造は、Tyr-146が二重の役割を果たし、リボースリン酸を押し上げてSer-148およびArg-152と相互作用させるだけでなく、同時にNADP+のリボースホスホリル酸素と水素結合することを示しています。 (O2X)。 さらに、efHMGR では、フラップ ドメインの 2 番目と 3 番目のヘリックスの間のループに存在する Gln-410 (C) の主鎖アミド基は、Gln-410 のリボース-リン酸酸素から潜在的な水素結合距離 (3.4 Å) のところにあります。 NADP+ (O3X)。 アデニン-3'-リボース-ヒドロキシル部分とGln-410の側鎖カルボキサミド基との間に水媒介相互作用が観察される。 (図2b)。 SpHMGR ではこれらの構造のフラップが活性部位から離れた開いた配置に位置しているため、これらの相互作用は観察されませんでした 18。

HMGR 酵素では、リガンド結合時に活性部位を覆う C 末端フラップ ドメインが触媒作用において重要な役割を果たします。 クラス I (古細菌および真核生物) のホモログ 34 では、これは比較的短く、クラス II 細菌酵素に特徴的な大きな 3 つのらせん束の最初のらせんのみで構成されています 15。 このより大きなフラップ ドメインの重要性は明らかではありませんが、公開された結晶構造は、細菌の 3 らせんバンドルがリガンドの侵入、出口、および触媒作用中にいくつかの立体構造再配置を受けることを示しています 18、20、32 (補足注 3)。

ヒトと細菌の両方の HMG-CoA レダクターゼによって触媒される複雑な反応機構の各段階の一般的なスキームについては一致しています。 最初に、HMG-CoA と NADH/NADPH の両方の結合により、活性部位上のフラップ ドメインの順序付けと閉鎖が誘導されます。 次に、HMG-CoA のチオエステルは最初の水素化物転移によって還元され、得られたオキシアニオンは触媒の Glu-83 および Lys-267 によって安定化されます (pmHMGR 命名法)。 初期の研究では、得られるチオヘミアセタールがアルデヒドおよびチオアニオンと動的平衡にあるにもかかわらず、主要な中間体であることが実証されました 35,36。 フラップ ドメインは、酸化された NAD+/NADP+ の放出を可能にする構成を変更します。 これにより、NADH/NADPH の別の分子が結合し、その後、触媒作用のある Glu-83 によってアルデヒドが生成物であるメバロン酸に急速に還元されます。 触媒作用のある His-381 はチオアニオンにプロトンを供与して、2 番目の生成物 CoA-SH を形成します。 フラップは再び構成を変更し、これらの生成物と 2 番目の酸化 NAD+/NADP+ の排出を可能にします。 これらのステップの一部の詳細は、最近の分子動力学研究で確認されています29。

ここで報告されたリガンド結合した efHMGR 構造 (Ref-三元) は、NADP+ のみが活性部位に存在する場合にフラップが無秩序になることを示唆しています。 これらの構造では、フラップが閉じるためには、HMG-CoA + NADP+ またはメバロン酸 + NADP+ の組み合わせが存在する必要があります。 (図 3a ～ c​​)。 しかし、よく見ると、これら 2 つのリガンドの組み合わせでは、フラップ ドメインが異なる立体構造 (Cα の rms 偏差約 1.4 Å) を持っていることがわかります (図 3d)。 活性部位にメバロン酸と NADP+ がある (ダイマー CD) ため、フラップ ドメインは触媒 Ser-88 (D) から水素結合距離にある His-376 (C) と完全に閉じた立体配座で見られます。 2Fo-Fc 電子密度マップは、周囲の残基と同等の B 因子を持つ整然とした NADP+ 分子を示しています。 ニコチンアミド環のカルボキサミド基は、Asn-213 (D) の側鎖と水素結合します。 また、Asn-184 (D) のカルボキサミド基はニコチンアミドリボース酸素と水素結合 (3.1 Å) し、活性部位で補因子を固定します。 いくつかの直接および水を介した水素結合相互作用により、補因子と酵素のフラップドメインが結合されます。 ニコチンアミドリボース 2'-OH は大きなドメインの Asn-279 (C) (2.9 Å) と水素結合しますが、ニコチンアミドリボース 3'-OH はウェルを介して触媒作用のある His-376 (C) とも相互作用します。規則正しく増殖する水素結合水分子 (His-376 (2.9 Å)、Gln-380 (C) (2.8 Å)、ribose-3'-OH (2.9 Å)、Asn-184 (D) (3.0 Å)) 。 このらせんのさらに 1 回転下では、Gln-380 (C) が 2 つの水を介した水素結合を介して Glu-85 (C) とさらに結合します。 この相互作用の網は、触媒作用のある His-376 を Ser-88 および HMG-CoA のチオエステル部分の近くに保つのに役立ちます（図 3e）。 他の細菌レダクターゼで見られるように、フラップ ドメインの最初のヘリックスのさらに下では、Met-386 (C) が Met-53 (D) および Val-329 (D) と疎水性相互作用を行い、リダクターゼの本体との相互作用を媒介します。酵素。 公開されている pmHMGR (PDB: 4i4b, 1qax) の三元複合構造 20,32 では、整然とした NAD+ も His-381 との同様の相互作用を促進し、フラップ ドメインを完全に閉じた立体構造に保ちます。 Miller ら 18 は、apo-SpHMGR と NADPH が結合した SpHMGR 構造において、フラップは規則的であるが、開いた立体構造を採用していることを観察しました。 この構造では、フラップは基質および補因子結合部位から離れています 18。 それらの観察は、リガンドと補因子の両方が結合しない限りフラップが観察されないというｅｆＨＭＧＲおよびｐｍＨＭＧＲの両方とは異なる。 したがって、リガンドが存在しない場合、フラップ ドメインは柔軟性があり、アポ HMGR 構造では解決されない可能性がある複数の開いた立体構造を獲得できる可能性が非常に高くなります。

a efHMGR のアポおよび NADP+ 結合型では、フラップ ドメインが乱れています。 活性部位に NADP+ のみが結合している場合、フラップ ドメインは無秩序であり、NADP+ のニコチンアミドリボース部分には観察可能な 2Fo-Fc 密度がありません。 b HMG-CoA および NADP+ の存在下では、フラップ ドメインは部分的に閉じています (青色)。 この場合、1.0σ 2Fo-Fc 密度でわかるように、NADP+ のニコチンアミドリボース部分も乱れています。 c 1.0σでの2Fo-Fc密度から明らかなように、メバロン酸および完全に秩序化されたNADP+分子の存在下では、フラップドメインは完全に閉じています(マゼンタ)。 d メバロン酸 + NADP+ 結合モノマー上の HMG-CoA + NADP+ 結合モノマーの重ね合わせは、完全に閉じた立体構造 (マゼンタ) と比較して、部分的に閉じたフラップ ドメイン (青) が 15° 回転していることを示唆しています。 e 整然とした NADP+ 分子の存在下で完全に閉じたフラップ (マゼンタ) を安定化させる相互作用をここに示します。 完全に閉じたフラップ内のいくつかの残基 (His-376 および Gln-380) は、水を介した相互作用を介して NADP+ のニコチンアミドリボース部分と相互作用します。 小ドメインに存在する残基 Asn-184 は、ニコチンアミドリボース部分を締め付け、水媒介相互作用にも関与していることが見られます。 触媒作用のある His-376 は、部分的に閉じたフラップ (青色) のさらに離れたところに配置されます。 水は赤い球として示され、水素結合相互作用は赤い破線として表され、距離はÅで示されます。

ただし、活性部位（ダイマー AB）に HMG-CoA と NADP+ がある場合、efHMGR のフラップ ドメインは、HMG-CoA 結合 SpHMGR 構造（PDB: 5wpk）と同様に、「部分的に閉じた」立体構造で観察されます 18。 このフラップは、標準的な pmHMGR フラップ (PDB: 4i4b、1qax) と比較して 15°回転しており 20,32、この回転により、活性部位ヒスチジン (His-376) が Ser-88 および CoA スルフヒドリル付近の作用部位から移動し、再配向されます。グループ。 さらに、NADP+ 分子はアデニン - リボースからピロリン酸部分までのみよく秩序立っていますが、高い B 因子 (約 65 ～ 70 Å2) と観察可能な 2Fo-Fc の欠如によって明らかなように、ニコチンアミドとニコチンアミドリボース部分は無秩序です。密度。 その結果、フラップドメインとNADP+のニコチンアミドリボース部分との間に相互作用は見られず、それによりフラップは比較的柔軟になり、補因子結合部位を露出させる異なる立体構造に自身を配向することができる（図3b、d）。 我々は、他の細菌相同体のほとんどの場合と同様に、部分的に閉じた立体構造も結晶の充填によって生じた可能性があることを認識しています。 しかし、フラップのこの構造は、反応の過程におけるフラップの柔軟性の構造的証拠を提供します。

最初の水素化物転移に続く補因子交換ステップでは、酸化された NADP+ が活性部位から出て、続いて還元された等価物が結合しますが、触媒作用には重要です。 さまざまな細菌ホモログのいくつかの構造は、フラップ ドメインが複数の立体構造を交互に切り替えて、この補因子交換を促進していることを示唆しています。 我々の構造データは、フラップが閉じるには基質部位と補因子部位の両方が占有される必要があることを示しています。 ただし、フラップ ドメインの閉鎖の程度と Ser-88 に対する His-376 の位置は、NADP+ のニコチンアミドリボースとフラップ ドメインの最初のヘリックスの間の相互作用に依存します。 NADP+ の規則的なニコチンアミド – リボース 3'-OH 基は、水を介した水素結合ネットワークを介して、触媒作用のある His-376 を含むフラップのいくつかの残基との相互作用を促進します。 これは、pmHMGR 流産複合体および生産複合体で以前に見られたような完全に閉じた立体構造を示しています。 しかし、ニコチンアミドリボース基が乱れている場合、これは補因子が活性部位から出ようとしている状況を表しており、この水素結合ネットワークが除去されると、フラップドメインは自由になり、補因子を残した部分的に閉じた立体配座に再配向します。結合部位が開いていてアクセス可能であること。 私たちのデータは、HMG-CoA 単独の存在下でフラップの部分的な閉鎖を視覚化し、最初の水素化物転移の後、フラップ ドメインが NADP+ 結合部位から離れることを示唆した Miller ら 18 によって立てられた仮説を裏付けています。中間体を酵素に結合させたまま補因子の交換を可能にします。

Southern Research Institute (SRI) と協力して、Chembridge 2、SRI、および Molecular Libraries Screening Center Network (MLSCN) データベースからの 300,000 化合物のライブラリーを、ハイスループット アッセイを使用してスクリーニングしました (方法)。 阻害活性を用量反応スクリーニングで確認し、IC50 値を決定しました。 このアッセイには、メバロン酸の HMG-CoA への酸化反応が含まれ、NADP+ から NADPH への変換が 340 nm で分光測光的に測定されました。 阻害剤のうち 26 種類がパーデューでのさらなる試験のために選択されました。 Chembridge 2パネルからの化合物の1つ、ID 7828315（以下、315と呼ぶ）（図4a）は、7.1μMのIC50値でefHMGRを強力に阻害することが見出された（図4b）。 次に、化合物 315 の阻害の速度論的機構を、メバロン酸の濃度を 315 の固定可変濃度で変化させることによって、メバロン酸から HMG-CoA の方向で決定しました。図 4c に示す結果は、化合物 315 がメバロン酸に対する競合阻害剤であることを示しています。 efHMGR の場合、結果として Ki 値は 2.0 μM になります。 化合物 315 は、100 μM の濃度でこの反応においてクラス I ヒト酵素の阻害を示さないため、クラス II HMGR に対して特異的であると考えられます。

a 315 (Chembridge2 ID 7828315) の化学構造: 5-{[(4-ブチルフェニル)アミノ]スルホニル}-2-ヒドロキシ安息香酸。 この化合物は、アミノ基とスルホニル基を介して 2-ヒドロキシ安息香酸に結合した疎水性 4-ブチルフェニル基で構成されています。 b E.フェカリスHMG-CoAレダクターゼに対する315の用量反応曲線。 ＩＣ５０値は、阻害％対阻害剤濃度データのミカエリス・メンテンフィッティングによって推定した。 アッセイは三重反復で実施した。c ラインウィーバー プロットは、315 が efHMGR の競合阻害剤であることを示している。 このプロットの分析は、315 がメバロン酸の HMG-CoA への変換を 2 μM の Ki で阻害することを示しています。 アッセイは、その他の標準条件下で、0、5、7.5、および10μMの315の存在下で二重に実施した。 両方のデータセットは Graphpad Prism 9.0 によって分析され、個別のデータ ポイントとして表示されました。

化合物 315、5-{[(4-ブチルフェニル)アミノ]スルホニル}-2-ヒドロキシ安息香酸 (図 4a) は、スルホンアミド基を介して 2-ヒドロキシ安息香酸に結合した疎水性 4-ブチルフェニル基で構成されており、模倣します。天然メバロン酸/HMG-CoA基質の多くの相互作用。 315によるefHMGRの阻害の分子詳細を調べるために、阻害剤とefHMGRとの複合体を結晶化した(方法)。 これらの結晶は、アポ型またはリガンド型よりもはるかによく秩序立っていることが証明され、1.27 Å まで解析される高分解能構造が得られました (表 1、Ref-315)。 efHMGR の活性部位における 315 の明確な電子密度は、結合に重要な 315 の構造的特徴を実証しました。 315 の 2-ヒドロキシ安息香酸部分は主に酵素の深部にあるメバロン酸結合ポケットを占め (図 5a)、メバロン酸基質の結合相互作用の一部を複製します。 次に、アミノスルホニルブチルフェニル基は、HMG-CoA の CoA 部分が占有している大部分が疎水性の裂け目に伸びます。 HMG-CoA/メバロン酸を含む構造と 315 阻害された構造を重ね合わせると、この化合物が天然の基質と同様の空間を占めることがわかります。 したがって、構造データは、315が2μMのKi値を有するメバロン酸酸化の競合阻害剤であるという速度論的データを裏付ける(図4c)。

二量体界面に存在するメバロン酸結合ポケット内の315結合を示す静電ポテンシャルマップ。 安息香酸部分は荷電残基で裏打ちされたポケットの内側に押し込まれており、315 のブチルフェニル基は疎水性環境に収容されています。 b efHMGRの315とメバロン酸ポケット残基の間の相互作用を示すリグプロット図。 水素結合の相互作用は緑色の破線、水はシアン色の球、疎水性接触は茶色の半円で表されます。 c 親水性相互作用により、efHMGR のメバロン酸結合ポケット内の 315 が安定化します。 緑色の大きなドメイン残基、Glu-86、Pro-87、Arg-257、Asn-267、および Gln-359 は、直接および水を介した水素結合相互作用を介してリガンドと相互作用します。 隣接するモノマーの青色の Asn-187 および Asn-213 の小ドメイン残基も、水分子を介してリガンドと相互作用します。 赤い球は水分子を表します。 赤いダッシュは水素結合相互作用を表し、数字は水素結合距離をÅで示します。 d 疎水性相互作用も活性部位の 315 を安定化します。 Ala-92、Ala-362、Ala-363​​、Ala-366、Ile-372、His-376 などの疎水性残基は、疎水性ブチルフェニル基に対して固まり、リガンドを安定化します。 残基は、ファンデルワールス半径が点線の球である棒として表されます。

いくつかの直接および水を介した水素結合相互作用により、阻害剤の活性部位が安定化されます (表 2)。 315の安息香酸部分のカルボキシレート基と、活性部位ポケットの奥深くに位置するArg-257(A)のグアニジニウム基との間に2つの直接的な水素結合相互作用が観察される(図5b、c)。 この相互作用は、HMG/メバロン酸のカルボキシル基と Arg-257 の間の相互作用に類似しています。 結合スルホニルアミノ基のスルホニル酸素は、Asn-267 (A) 側鎖アミド基と水素結合相互作用を形成します。 他のスルホニル酸素と Gln-359 の側鎖アミド基の間には、潜在的な弱い水素結合相互作用も観察されます (A)。

いくつかの疎水性相互作用も活性部位の阻害剤を安定化します。 315 の安息香酸部分は、残基 Leu-367 (A) および Ile-210 (B) との疎水性相互作用によって安定化されます。 315 のブチルフェニル部分は、酵素の表面近くの疎水性裂け目に収容され、長いαヘリックスに存在する残基 Ala 362、Ala-363​​、および Ala-366 との密接な疎水性接触 (4.0 ～ 5.0 Å) によって安定化されます。 350-370) はフラップ ドメインの前にあります。 フラップドメインの前のループに存在するIle-372(A)は、阻害剤の屈曲部に寄り添います(図5b、d)。

さらに、いくつかの構造水分子が活性部位の周りを並び、阻害剤と酵素を接続する水素結合ネットワークを形成します。 水分子は、efHMGR の小ドメインの Asn-187 (B) と 315 の安息香酸部分の 2-ヒドロキシ基の間の水素結合相互作用を媒介します。2 番目の水は、315 の安息香酸部分のカルボン酸塩と 315 の安息香酸部分の 2-ヒドロキシ基を結合します。酵素の大きなドメインからのAsn-360（A）の側鎖アミド基とHis-261（A）の主鎖カルボニル酸素原子（図5b）。 同様の相互作用が、HMG-CoA のカルボキシル基と他のクラス II 構造の Asn-360 の間でも観察されます。 315 のアミノ基は、3 番目の水分子を介して活性部位残基、Glu-86 および Pro-87 と相互作用します (図 5b、c)。 これらの水媒介相互作用は、efHMGRに対する親和性をさらに高めるためにリード最適化ステップで修飾できる阻害剤内の潜在的な部位を示しています（図5b、c）。

フラップの 3 つのヘリックスは規則正しく、最初のヘリックスは 315 の存在下で活性部位上で部分的に閉じていることがわかります。315 結合構造の活性部位に NADP+ が存在しないため、フラップにとって重要な必要な相互作用が妨げられます。完全に閉じます。 フラップの同様の立体構造は、HMG-CoA および部分的に規則正しい NADP+ の存在下で三元 efHMGR 構造でも観察されました。 315 のブチルフェニル基は、同じモノマーのフラップ ドメインだけでなく、大きなドメインの残基によって形成された疎水性ポケットにもよく収容されています。 フラップの最初のヘリックスに存在する Ile-372、His-376、および Leu-379 は、片側の疎水性ポケットのラインを形成しますが、Ala-92、Ala-362、および Ala-362 などの大きなドメイン (同じモノマーの) からのいくつかの残基は、 363 は反対側を構成します (図 5d)。 フラップの部分的な閉鎖は、315 のブチルフェニル基とフラップの間の疎水性相互作用によって達成され、触媒作用中に NADPH 結合を妨げる可能性があります。

以前の研究では、仮想スクリーニングによって同定され、分子ドッキング、部位特異的突然変異誘発および酵素アッセイによっても検証された、SpHMGR に対するいくつかの阻害剤が報告されました。 これらの化合物は、低マイクロモル濃度の IC50 で SpHMGR を阻害し、HMG-CoA と NADPH の間の結合腔を標的としました。 化合物 4 の 3-アミノ 1,2,5 オキサジアゾール部分は NADPH 結合ポケットを占め、不変 Asn-212 と相互作用し、疎水性フェニル基は HMG-CoA 結合部位を占めました 37。 したがって、リード最適化の戦略は、３１５をＨＭＧ－ＣｏＡ結合ポケットを超えて拡張して、ＮＡＤＰＨ結合ポケットも占有するようにし、それによって阻害剤の効力および特異性を高めることである。

315 は 1 桁マイクロモル (7.1) IC50 で efHMGR を阻害しますが、100 μM でもヒト酵素を完全に阻害できません。 ヒト酵素と 315 の共結晶構造が存在しない場合、我々はヒト構造 (PDB: 1dq9)34 を Ref-315 に重ね合わせました。 我々の構造分析は、ヒト酵素の His-752 のイミダゾール側鎖が、大きなドメインの Lα5 と Lα6 の間の長いさまようループに由来し、315 のスルホニル酸素に対して立体障害を引き起こしていることを示唆しています。細菌ホモログでは、これはかさばる His-752 は、長いアルファ ヘリックス (Lα5 に類似) に由来し、315 と衝突しない Gly-264 で置換されます。efHMGR の Ala-363​​ の代わりにヒト ホモログ内の Leu-851 が存在することも同様です。 315の安息香酸部分と立体衝突を引き起こします（補足図5a）。 315 の安息香酸基に結合する原核生物の Arg-257 は、ヒトの酵素ではシスペプチドループ内のリジンに置き換えられ、2 つの水素結合のうち 1 つが除去されます。 水素化物移動のためのニコチンアミド環の構成も変化し、活性部位ポケットの輪郭に対する他の修飾が必要になります。 他のものとのこれらの違いは、細菌酵素に対する 315 の阻害剤の効力と選択性に顕著な違いをもたらした可能性があります。

以前の研究では、スタチンは、クラス I ホモログのナノモル阻害と比較して、efHMGR などのクラス II HMG-CoA レダクターゼの弱い阻害剤であることが示されています。 動態解析により、クラス II ホモログ、特に efHMGR を標的とする 315 はスタチンと比較して非常に強力であることが示されています。 50 μM 濃度では、ロバスタチンが 32% 阻害を達成するのに対し、315 は efHMGR の 80% 阻害を達成します。 分子レベルでの違いを理解するために、ロバスタチンに結合した pmHMGR 構造 (PDB: 1to2)38 を efHMGR 構造に重ね合わせ、ロバスタチンと efHMGR の間の相互作用を分析しました。 活性部位残基は 2 つのクラス II ホモログ間で保存されているため、ロバスタチンは同様の方法で efHMGR と相互作用するはずであると仮定されます。 したがって、Arg-257 と 315 の安息香酸部分の間の 2 つの水素結合相互作用の代わりに、Arg-257 とロバスタチンのカルボン酸基の間に 1 つの水素結合のみが観察されます。 315とefHMGRの間の4つの直接および4つの水媒介水素結合相互作用と比較して、ロバスタチンはefHMGRと3つの直接および2つの水媒介相互作用を行います（補足図5b）。 315 のブチルフェニル基は、酵素の大きなドメインだけでなく、フラップ ドメインのいくつかの残基によって形成される広範な疎水性ポケットによく収容されています。 しかし、ロバスタチンのデカリン環はフラップドメインの閉鎖を妨げ、広範な疎水性相互作用は観察されません。

システムの正常なバイオームを乱すことなく病原性細菌を標的とすることは、抗菌薬を治療アプローチに使用するのに有利です。 一般的な腸内細菌はメバロン酸経路を使用しないため、MRSA (メチシリン耐性黄色ブドウ球菌) や (バンコマイシン耐性腸球菌) VRE などの病原性グラム陽性細菌種の HMGR を標的とした阻害剤は、他の有益な細菌を妨げることはありません。 これらの阻害剤の局所適用は、同様の病原性感染症にも有用であることが判明する可能性があります。 315 についての我々の最初の調査は、この足場に基づく化合物が細菌 HMGR に対して高度に選択的である可能性があることを示しています。 ヒトと細菌の酵素の活性部位の構造の違いをさらに利用して、315 と 2 つのクラスの HMG-CoA レダクターゼの間で観察された相互作用に基づいて、阻害剤の効力と選択性を最適化することができます。 さらに、315と相互作用するすべての活性部位残基はグラム陽性菌ホモログで高度に保存されており（補足図6）、共通の阻害剤でグラム陽性病原体を特異的に標的にし、それによって治療範囲が広がる可能性が高まっています。

E. faecalis mvaE 遺伝子の HMG-CoA レダクターゼ部分 (残基 381 ～ 803) を pET28a ベクターにクローニングし、Escherichia coli BL21 (DE3) 細胞で N 末端 6X-ヒスチジンタグとともに発現させました17。 細胞をカナマイシン（20μg.ml-1）の存在下、Luria Broth培地中で37℃で0.6〜0.7 O.D600まで増殖させ、0.5 mM IPTGで4時間誘導しました。 細胞を４０００ｇで２０分間ペレット化し、溶解緩衝液Ａ（１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、続いてフレンチプレッシャーセルにより１８，０００ｐｓｉで溶解した。 得られた細胞抽出物を超遠心機で40,000 rpmで1時間遠心分離しました。 上清（サイトゾル）をニッケル-NTA樹脂の2mlカラムにロードした。 カラムをバッファー A およびバッファー B (50 mM イミダゾール、20 mM HEPES pH 8.0、300 mM NaCl) で洗浄し、バッファー C (100 mM イミダゾール、20 mM HEPES pH 8.0、300 mM NaCl) およびバッファー D (それぞれ、500 mM イミダゾール、20 mM HEPES pH 8.0、300 mM NaCl）。 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (10% SDS PAGE) によって同定された efHMGR を含む画分は、約 50 KDa に単一のタンパク質バンドを示しました。 efHMGRを含む画分を一緒にプールし、4℃で1時間一定に撹拌しながら3倍量の飽和硫酸アンモニウム(pH7.0)を加えて沈殿させ、その後14,000rpmで20分間遠心分離してペレット化した。 ペレットを５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０および３００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。 タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定しました。 この構築物は、細菌培養物 1 リットルあたり 35 mg の N 末端 6X-His タグ付き HMGR タンパク質を発現します。 結晶化の前に、硫酸アンモニウムを交換するために、タンパク質を5 mM HEPES pH 8.0、300 mM NaClに対して透析した。

efHMGR アポ酵素 (Ref-apo) の初期結晶化条件は、ニューヨーク州バッファローのハウプトマン・ウッドワード医学研究所のロボット結晶化施設の支援を受けて選択されました。 最初のヒットはさらに最適化され、efHMGR アポ酵素の六方晶系 P61 結晶が得られました。これは、10 mg.ml-1 のタンパク質 3 μl および 0.1 M MES pH 6.5 3 μl を含む溶液から 20 °C で静置滴下蒸気拡散法によって成長させました。 、50 mM 酢酸カルシウム、16% PEG8000。 アポ酵素の結晶は、20 °C で 15 ～ 20 日で 0.4 × 0.2 × 0.1 mm のサイズまで成長しました。 100 K でのデータ収集のために、結晶化緩衝液中の 20% PEG400 を段階的に導入して結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷凍しました。

三元複合体（Ref-三元）の場合、efHMGR は、20 °C でのシッティングドロップ蒸気拡散技術を使用して NADP+ および HMG-CoA と共結晶化されました。 板状 C2 結晶は、1.5 mM NADP+、150 μM HMG-CoA、0.1 M MES pH 6.7、50 mM 酢酸カルシウム、および 8% PEG 8000 の存在下で出現しました。これらの試験では、10 mg.ml-1 のタンパク質が使用されました。 。 結晶は 1 ～ 2 日で現れ、最終サイズ 0.2 × 0.1 × 0.05 mm3 まで成長しました。 結晶を結晶化緩衝液中の35%グリセロールで凍結保護し、液体窒素中で急速冷凍した。

阻害剤 315 のストック溶液は、100% DMSO に溶解することによって調製されました。 efHMGR タンパク質と阻害剤 315 (Ref-315) の複合体を、25% PEG 4000、0.17 M 酢酸ナトリウム、pH 8.5 の 0.085 M Tris-HCl、および 2% グリセロール中で共結晶化させました。 タンパク質は、5 mM HEPES pH 8.0、300 mM 塩化カリウム、650 μM 315阻害剤、1.6% DMSO、および微量の硫酸アンモニウムおよびイミダゾール中で14 mg.ml -1 であった。 棒状の P212121 結晶が数日で出現し、最終サイズ 0.04 × 0.04 × 0.275 mm3 まで成長しました。 結晶を結晶化緩衝液中の15% PEG 400中で凍結保護し、液体窒素中で急速冷凍した。

Ref-apo 結晶の 2.25 Å までのネイティブ回折データは、Advanced Photon Source (APS、アルゴンヌ国立研究所、イリノイ州アルゴンヌ) の SERCAT-ID ビームラインで CCD 検出器を使用して収集されました。 ref-apo 結晶は、非対称ユニット内の 4 つのモノマーと a、b = 168.7 Å、c = 120.2 Å、α、β = 90°、γ = 120°のセル寸法を持つ P61 空間群で成長しました。

Ref 三元結晶の単結晶回折データは、Rayonix (MAR 300) CCD 検出器を備えた APS の SERCAT-BM ビームラインで収集されました。 データはインデックス付けされ、統合され、2.27 Å にスケール化されました。 結晶格子は単斜晶系空間群 C2 に属し、a = 241.3 Å、b = 62.6 Å、c = 171.9 Å、α = 90°、β = 133.5°、γ = 90°であり、非対称単位ごとに 4 つのモノマーがあります。

阻害剤 315 と複合体を形成した efHMGR の結晶構造は、CCD 検出器を使用して GM/CA ビームラインの APS で収集されました。 データはインデックス付けされ、統合され、1.27 Å にスケール化されました。 結晶格子は斜方晶系空間群 P212121 に属し、a = 72.5 Å、b = 81.1 Å、c = 152.9 Å、α、β、γ = 90°、非対称単位あたり 2 つのモノマーを持ちます。 Ref-apo、Ref-ternary、および Ref-315 データセットのデータ処理と削減はすべて HKL200039 を使用して行われ、統計が表 1 にまとめられています。

efHMGR アポ酵素構造の初期相情報は、CCP4 スイートの Phaser40 を使用した非対称ユニット内の 2 つの二量体の初期検索モデルとして pmHMGR 二量体 (PDB: 1qax、efHMGR との配列同一性 38%) を使用した分子置換によって得られました。 残基 13 から 370 は電子密度マップでモデル化され、剛体リファインメントが実行されました。 このモデルはその後、電子密度マップを改善するためのプライムおよびスイッチ密度修正手法を含む Resolve42 の対象となりました。 この初期モデルは、まず CNS スイートでシミュレーテッド アニーリングの改良を受けました 43。 その後、このモデルは、個々の B 因子改良、REFMAC44 での勾配最小化、その後の Coot45 でのモデル補正と溶媒配置の反復サイクルによって、2.25 Å データセットに対して修正、拡張、および改良されました。 部分占有、複数の立体配座、カルシウムイオン、2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸 (MES) 分子、および追加の水分子がモデルに追加されました。 後の段階では、モデルは Phenix の洗練 46 で最終的な改良サイクルを受けました。 最終モデルは、鎖 A の残基 11 ～ 370、鎖 B の残基 13 ～ 372、鎖 C の残基 11 ～ 370、鎖 D の残基 13 ～ 369 を持つ 4 つのモノマー、5 つの MES 分子、2 つの硫酸塩、4 つのエチレングリコール、6 つのジエチレンで構成されます。グリコール、10 個のカルシウムイオン、および 646 個の水分子、Rwork と Rfree はそれぞれ 17.5 と 20.9 です。 改良後、Procheck47 と Molprobity48 を使用してモデルのエラーが評価されました。

リガンド結合 efHMGR (Ref-三元) 構造は、天然の apo-efHMGR を検索モデルとして使用して解析されました。 結果として得られたモデルに対して剛体の改良が実行され、続いて Resolve42 によってモデルのバイアスが低減されました。 この段階で計算された Fo-Fc 差密度は、すべてのモノマーの活性部位における余分な密度を示しました。 これにより、基質 HMG-CoA、生成物メバロン酸、および補因子 NADP+ をモデル化することができました。 さらに、4 つのモノマーのうち 2 つの残基 370 (アポ酵素の最後に見える残基) を超えたタンパク質の C 末端の余分な密度の大きな領域が観察され、C 末端の 51 アミノ酸を含む柔軟なフラップを構築するために使用されました。モノマー (370 – n421) および B モノマーの 34 残基 (370 – 421)。 この初期モデルは、最初に数サイクルの個別の B 因子改良を受け、続いて CNS でシミュレートされたアニーリング改良が行われました。 その後、モデルは Coot での対話型モデル構築と溶媒配置によって修正および拡張され、続いて REFMAC と Phenix Refining でさらに数サイクルの制限されたリファインメントが行われました。 最終モデルは、電子密度マップでモデル化されたチェーン A の残基 13 ～ 370、チェーン B の -4 ～ 421、チェーン C の残基 0 ～ 421、およびチェーン D の 13 ～ 369 を持つ 4 つのモノマー、1 つの HMG-CoA、1 つのモノマーで構成されます。メバロン酸と 4 個の NADP+ 分子、7 個のカルシウムイオン、9 個の酢酸塩、7 個のグリセロールと 340 個の水分子、Rwork と Rfree はそれぞれ 19.6 と 23.9 です。

阻害剤 315 と複合体を形成した efHMGR 構造は、リガンドのない efHMGR モノマーを検索モデルとして使用して解析されました。 この構造は、最初はシミュレーテッド アニーリングとその後の共役勾配法を使用して Phenix で精密化されました。 活性部位における明確なFo-Fc密度により、活性部位における阻害剤の存在が明らかになった。 阻害剤のモデルは Chemdraw で構築され、エネルギーは eLBOW モジュール 49 で最小化され、Phenix の LigFit モジュールを使用して配置されました。 改良の間に、Fo-Fc 密度差で示される COOT を使用してモデル構造が調整されました。 最終モデルは、鎖 A の残基 13 ～ 421、鎖 B の残基 13 ～ 422、1 つのカルシウムイオン、2 つの阻害剤 (315) 分子、3 つの硫酸塩、および 973 の水分子を持つ 2 つのモノマーで構成されます。 すべてのモデルの改良後のエラーは、Procheck47 と Molprobity48 を使用して評価されました。 すべてのモデルは、ラマチャンドラン プロットの外れ値領域に残基のない良好なジオメトリを示しています。 データ収集と精製統計を表 1 にまとめます。タンパク質リガンド相互作用は、Ligplot50 を使用して分析されます。 図は Pymol51 を使用して生成されました。 配列は Tcoffee 多重配列アラインメント プログラムによってアラインメントされ、Espript52 を使用して視覚化されています。

化合物の投与/プレーティング: DMSO 中の化合物 25 ナノリットル (nL) を 384 ウェルの透明な非結合表面処理プレートに分注し、アッセイにおける化合物の最終濃度 10 μM となりました。

アッセイバッファー中にコエンザイム A、NADP+、およびメバロン酸を含む HMG-CoA レダクターゼ試薬混合物 15 μL を、事前に化合物を投与した 384 ウェル プレートの各ウェルに添加しました。 反応は、アッセイバッファーで希釈した 10 μL の HMG-CoA レダクターゼを添加して開始しました。 反応中の最終濃度は、アッセイ緩​​衝液（100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、100 mM 塩化カリウム）で希釈した2 mM コエンザイム A、4 mM NADP+、4 mM メバロン酸、および 15 μg.ml-1 HMG-CoA レダクターゼでした。 、2% DMSO および 0.01% Tween 20)。 テストプレートを直ちに Perkin Elmer Envision マイクロプレートリーダーに移し、NADPH の吸光度を 16 秒ごとに 160 秒間 340 nm で測定しました。 各プレートには、外側の 4 つのカラムに 64 個の対照ウェルがあり、そのうち 32 個には担体対照を含む完全な反応混合物 (完全反応) が含まれ、残りの 32 個にはメバロン酸塩が省略されていました 53。

一般的なスタチンであるロバスタチンおよび 315 によるメバロン酸の HMG-CoA への酸化的アシル化の阻害を、ほぼ同様の反応条件を使用して 2 つの異なる種の HMG-CoA レダクターゼについて研究しました。 簡単に説明すると、反応液 (100 μL) を 96 ウェル、透明、平底、半面積プレート (Corning Costar、メイン州ケネバンク) にセットアップしました。 まず、2.5μLの化合物を勾配濃度でウェルに添加し、続いてマスター混合物を添加した。 マスター混合物の組成は、2 つのクラスのレダクターゼ間でわずかに異なります。 efHMGR の場合、マスター混合物の組成は次のとおりです。 100 mM KCl、100 mM トリス HCl、1.5 mM コエンザイム A、4.5 mM メバロン酸、3 mM NADP+ および水で濃度を調整します。 ヒト HMG-CoA レダクターゼの場合、マスター混合物の組成は次のとおりです。 50 mM NaCl、100 mM Tris HCl、1 mM EDTA、5 mM DTT、5 mM コエンザイム A、6 mM メバロン酸、5 mM NADP + および水を加えて濃度を調整します。 阻害剤とマスター混合物を加えたプレートを、ベースラインが安定するまで 37 °C で 3 分間インキュベートしました。 適切な量​​の酵素を添加して最終体積を100μLにすることによって反応を開始した。 NADP+ の減少は、340 nm での吸光度を測定することにより 37 ℃で継続的に監視されました。 CLARIOstar Plusプレートリーダー(BMG Labtech、ノースカロライナ州ケアリー)を使用して20秒ごとに吸光度を読み取った。 進行曲線の初期の読み取り値を使用して、初期傾き (IS) を計算しました。 IC50 値は、GraphPad Prism 9 (GraphPad Software、San Diego、CA、USA) での非線形回帰を使用した、阻害 % 対阻害剤濃度データの Michaelis-Menten フィッティングを通じて推定しました。 各実験は同一のアッセイ条件下で３回実施した。 酵素の非存在下でのアッセイを実験対照として使用して、ベースラインの傾きを決定しました。 阻害％は以下の式に従って計算した。

メバロン酸酸化アッセイは、200 μl の反応容量で 37 °C で実行され、反応は 340 nm での NADPH の出現によってモニタリングされました。 標準アッセイ条件には、4 mM NADP+、1 mM コエンザイム A、以下の濃度のメバロン酸が含まれていました: 0.2 mM、0.33 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.67 mM、1 mM、2 mM。 阻害剤 (315) の濃度も 5 μM、7.5 μM、10 μM と変化させました。 アッセイ緩​​衝液は、１００ｍＭ ＫＣｌおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０から構成された。 メバロン酸、NADP+、および阻害剤 315 をアッセイバッファー中で 37 °C でインキュベートし、酵素の添加によって反応を開始しました。 Ki 値は、他のアッセイ条件を標準に保ち、上記のようにメバロン酸濃度を変化させて測定しました。 この阻害研究の二重逆数プロットが得られ、1/初速度が 1/基質濃度の関数としてプロットされ、データが Graphpad Prism 9.0 の線形回帰によってフィッティングされました。 このグラフからKM(見かけ)とKmを求めました。 Ki 値は次の方程式に基づいて計算されました。

Uniprot データベースから使用される配列のアクセッション番号:

Q8DNS5: 肺炎球菌 HMG-CoA レダクターゼ

Q9FD86: 黄色ブドウ球菌 HMG-CoA レダクターゼ

Q9FD60: 化膿レンサ球菌 HMG-CoA レダクターゼ

A0A7ZD9J92: Enterococcus hirae HMG-CoA レダクターゼ

Q9FD65: Enterococcus faecium HMG-CoA レダクターゼ

Q8Y8R9: リステリア モノサイトゲネス HMG-CoA レダクターゼ

P13702: シュードモナス メバロニ HMG-CoA レダクターゼ

A9BQX8: デルフィア アシドボランス HMG-CoA レダクターゼ

B4EKH5: バークホルデリア セノセパシア HMG-CoA レダクターゼ

Q9FD70: エンテロコッカス・フェカリス HMG-CoA レダクターゼ

反応速度論データは、GraphPad Prism バージョン 9.0 ソフトウェアを使用して分析されました。 データは個々のデータ ポイントとして表示されます。 再現性は、図の説明に記載されているように、図 4b では 3 つの独立したデータ ポイント、図 4c では 2 つの独立したデータ ポイントを実行することによって確認されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

議論されたすべての反射データと結晶構造の最終座標は、次のアクセッション コード - E. 表1に記載されているように、フェカリスHMG-CoAレダクターゼapo（7M66）、HMG-CoA、メバロン酸およびNADP +結合（7M1Z）および化合物315結合（7M3H）。図に示されている動態グラフの背後にあるすべてのソースデータは補足に示されています。データ 1 と補足データ 2。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、国立衛生研究所の CVS への助成金 R01 GM111645 および R03 MH082373 によって支援されました。この研究では、米国エネルギー省 (DOE) 科学局ユーザー施設である高度光子源のリソースが使用されました。この研究は、DOE 科学局のために運営されていました。アルゴンヌ国立研究所は契約番号 DE-Ac02-0CH11357 に基づいています。 データは APS GM/CA ビームラインで収集されました。 GM/CA@APS は、国立がん研究所 (ACD-12002) および国立総合医科学研究所 (AGM-1200、P30GM138396) から資金提供を受けています。 著者らは、パーデューがん研究センターの高分子 X 線回折施設 (P30 CA023168) の支援に感謝します。 結晶化条件の最初のハイスループットスクリーニングを行っていただいた Hauptman Woodward 結晶スクリーニング施設と、efHMGR を用いた化合物のハイスループットスクリーニングアッセイを実施していただいたアラバマ州サザン研究所の Lucille White 博士に感謝いたします。 この出版物は DLP によって個人の立場で書かれたものであり、食品医薬品局、保健福祉省、連邦政府の意見を表すものではありません。

スチャリタ・ボーズ

現在の住所: Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine, GKVK Post Bellary Road, Bangalore, 560065, India

ダネリ・ロペス・ペレス

現在の住所: Food and Drug Administration、10903 New Hampshire Avenue、Silver Spring、MD、20993、USA

モハメド・N・セリーム

現在の住所: 生物医学および病理生物学部、バージニア工科大学獣医学科、バージニア工科大学、205 Duck Pond Drive、Blacksburg、VA、24061、USA

パデュー大学生物科学部、915 West State Street、ウェストラファイエット、インディアナ州、47907、米国

スチャリータ・ボーズ、C. ニクラウス・ステューシー、ティム・シュミット、サマディ・C. クラトゥンガ、アンドリュー・D・メセカール、シンシア・V・シュタウファッハー

パデュー大学化学科、560 Oval Drive、ウェストラファイエット、インディアナ州、47907、米国

ダネリ・ロペス・ペレス & マーク・リプトン

パデュー大学獣医学部比較病態生物学部、625 Harrison Street、West Lafayette、IN、47907、USA

モハメド・N・セリーム

パデュー大学生化学部、175 South University Street、ウェストラファイエット、インディアナ州、47907、米国

アンドリュー・D・メセカー & ビクター・W・ロドウェル

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SB は efHMGR タンパク質を精製し、apo 構造とリガンド構造を結晶化して精製しました。 DLP は 315 を合成、精製し、特性評価しました。最初に、SB は 1.7 Å まで回折した efHMGR と 315 を共結晶化しました。 その後、CNS と TS は再び 315 をタンパク質と共結晶化し、構造を解析してより高い分解能 (1.27 Å) まで精密化しました。 CNS は、apo およびリガンド結合構造の最終段階の精製を実施しました。 SBおよびCNSは315阻害剤を用いたefHMGRの動態実験を実施し、SCKはefHMGRおよびヒトHMGRに対する315およびロバスタチン阻害剤のIC50実験を実施した。 MNS と ML は、阻害剤のさらなる開発の可能性を評価し、VWR は efHMGR の精製プロトコールを開発し、スクリーニングされた化合物を使用して初期反応速度実験を実施しました。 ADM、MLCNS、CVS がプロジェクトを調整しました。 SB、CNS、CVS は構造を分析し、著者全員からの意見をもとに論文を執筆しました。

シンシア・V・シュタウファッハーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Yan Kung と Jeff Watson に感謝します。 主な取り扱い編集者: Gene Chong。

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転載と許可

Bose, S.、Steussy, CN、López-Pérez, D. 他非スタチン阻害剤による Enterococcus faecalis HMG-CoA レダクターゼの標的化。 Commun Biol 6、360 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04639-y

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受信日: 2021 年 9 月 28 日

受理日: 2023 年 2 月 28 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04639-y

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