ニッケルキトサンナノ複合体の小麦フザリウム腐病と闘うための抗真菌剤としての応用

Scientific Reports volume 12、記事番号: 14518 (2022) この記事を引用

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農業研究者は、農地への合成殺菌剤の使用に代わる目的で、抗真菌特性を持つ可能性のある生体分子を導き出そうと絶えず試みています。 Fusarium solani によって引き起こされることが多い腐敗病により、小麦作物は毎年深刻な被害を受けました。 キトサンとその金属ナノ誘導体は、広範囲の抗真菌特性を保持します。 私たちの学際的な研究では、キトサン ナノ粒子 (CNP) および市販の殺菌剤マンコゼブと比較して、小麦のフザリウム腐病に対するニッケル キトサン ナノ複合体 (NiCNC) の適用を扱っています。 CNP と NiCNC は、UV-Vis 分光光度法、HR-TEM、FESEM、EDXS、FT-IR に基づいて特性評価されました。 CNP と NiCNC はどちらも真菌の増殖に対して有効であることが判明し、そのうち 0.04 mg/mL の NiCNC は、適切な培地で増殖した F. solani を完全に停止させました。 NiCNC で処理した F. solani 分生子の超微細構造分析により、膜表面の顕著な損傷と破壊が明らかになりました。 蛍光顕微鏡研究により、NiCNC に曝露されると真菌系で酸化ストレスが発生することが明らかになりました。 さらに、NiCNC は小麦苗の腐敗病の発生率を 83.33% 減少させました。これは茎の解剖学的断面の観察によってさらに確認されました。 NiCNC の適用は、苗木が病原体の悪影響を克服するのに役立ちます。この悪影響は、ストレス指数属性を通じて評価されました。

農業科学者にとって、経済的に重要な食用作物を大規模に破壊する真菌性疾患を制御することは、長年にわたる大きな課題でした。 真菌性病原体は世界の農業生産に重大な損失を与えました1、2、3、4。 そのような有害な病原体の 1 つはフザリウム属菌です。 それは広範囲の植物種に感染を引き起こします。 主に、萎凋病、頭枯病、根腐れなどの病気を引き起こします5,6。 小麦の根腐れ病（Triticum aestivum L.）は、根茎の基部付近で発生し、ヨーロッパ、アジア、北アメリカ、オーストラリアの主要な小麦栽培地域で多大な作物損失を引き起こす最も一般的な真菌性疾患の 1 つです7,8。 9、10。 いくつかの種のフザリウムは、小麦、大麦、オート麦などの小粒穀物に対する植物病原性真菌と考えられています。 2020 年に発表された報告の時点で、小麦に腐敗病を引き起こすフザリウム属の菌種はほぼ 9 種類あります 12。フザリウム ソラニ種は、小麦のような経済的に重要な主要作物で最も蔓延している腐敗病菌の 1 つです 13,14。 小麦の足腐れおよび根腐れは、主に Fusarium solani および Fusarium oxysporum によって引き起こされると報告されています 15,16。 フザリウム腐病の流行により、穀物生産量の大幅な減少と品質障害により、毎年深刻な作物損失が発生しています17。 腐敗病は植物の根元部分を攻撃し、葉への水と栄養素の流れを妨げます。 感染すると、フザリウム属のいくつかの種は、マイコトキシンと呼ばれる健康を脅かす二次代謝産物を生成します。マイコトキシンは植物内に蓄積し、その摂取は人間のシステムにとって致命的になる可能性があります18。 Fusarium solani 種は、神経毒性化合物であるネオソラニオールの前駆体である T-2 毒素 (T = トリコテセン) の最大の生産者です 19。 したがって、経済的に重要な主要作物におけるフザリウム・ソラニ腐敗病の管理は、収量損失を最小限に抑えるために極めて重要です。

近年、科学者はナノ粒子（NP）やナノ複合体（NC）などの多用途生体分子を設計し、真菌感染症の制御に利用しています20。 キトサンの生体適合性、生体膜への高い透過性、費用効果、低毒性、環境に優しい性質により、何人かの研究者がキトサンを NP または NC の合成に使用しています 21,22。 科学者たちは、キトサンが真菌病原体のさまざまな負に荷電した細胞成分に結合できるポリカチオン性の性質により、抗真菌剤であるとすでに結論付けています 23、24、25。 キトサンがキトサンナノ粒子（CNP）に変換されると、その表面積の増加とカプセル化効率の向上により、殺菌成分としての活性が増加します26。 CNP の次に、科学者らは、イオンチャネルゲル化法、エマルション架橋などの多彩な技術を通じて、ナノキトサンの金属結合体の合成を試みてきました 27,28。 しかし、金属ナノキトサンを有望な抗真菌剤として使用したという報告はほとんどない。 キトサンおよび CNP と比較して、キトサンと結合した金属 NP は、サイズと表面積の増加、より多くのカチオン基の存在、活性な官能基、およびより大きな凝縮能力など、構造的および機能的特性の変化により、より多くの生物学的活性を示します 28。

経済的に重要な主要作物におけるフザリウム感染の制御は、農業研究者にとって非常に困難な課題です。 輪作、植物の使用、生物学的防除、切り株管理などの防除戦略が農民に実践されているが、腐敗病の防除の成功率は満足できるものではなかった29、30、31、32。 種子処理または噴霧によるマンコゼブのような合成化学殺菌剤は、この病気をかなり程度まで制御すると報告されています33。 これまでの著者による報告では、足根腐れ病の原因となる F. solani の菌糸体成長を 50 ～ 100% 阻害するために Mancozeb を使用することを示唆した報告はほとんどありません 34,35。 しかし、その過剰な使用は、土壌や作物システムに対する毒性が高いため、環境的に好ましくありません36。 これに関連して、キトサンやその結合体のような環境に優しい生分解性分子を考慮することがより好ましい。 Ag、Cu、Zn、Fe、Ni などの金属ナノ粒子の抗病原体活性は、何人かの研究者によって以前に報告されています 37。 金属ナノ粒子が微生物に曝露されると酸化ストレスが発生し、これにより呼吸細胞の損傷が誘発され、膜透過性が崩壊することでタンパク質の漏出が増加します。 研究者のグループは、フザリウム種複合体に対する銀ナノキトサンの抗真菌効果を実証しました38。 しかし、銀のような高価な金属を発展途上国で農業に利用することは、政府だけでなく農民にとっても骨の折れる作業です。

金属ニッケルは、小麦苗（生重で 1 mg kg-1）の成長とクロロフィル含有量の向上に特に必要な必須微量栄養素です 39。 植物におけるその欠乏は、窒素代謝、鉄の取り込み、植物の成長および老化に悪影響を与える可能性があります。 しかし、より高いレベルの Ni2+ 曝露は植物に毒性をもたらし、土壌に蓄積してさまざまな健康被害を引き起こします40。 Ni2+ イオンが植物系の病害耐性能力を誘導することにより、多数の植物病原体に対して細胞毒性を示すという報告もあります 37。 ニッケルは、ウレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、メチルコエンザイム M レダクターゼ、アセチルコエンザイム A シンターゼなどのいくつかの金属酵素の構成要素として機能し、その結果、ニッケルの欠乏は酵素活性を低下させ、窒素同化に影響を与えます41。 これは、活性酸素種 (ROS) を直接生成しない不活性なレドックス金属です。 しかし、曝露レベルが高くなると、植物では脂質の過酸化や電解質の漏出が生じる可能性があります42。 したがって、ニッケルは植物の成長とその代謝の適切な機能に本質的に必要な重要な微量栄養素です。 ナノ粒子の合成にこの重要な金属を最小限の濃度で導入すると、植物病原体に対する合成分子の生物活性が強化されます。 現在まで、植物病原体に対するキトサン安定化ニッケルナノ粒子の使用に関する情報はほとんど提出されていない43。 しかし、壊滅的な病原体フザリウムに対するニッケルキトサンナノ複合体（NiCNC）の生物活性に関する情報はまだ記録されていません。

本研究では、トリポリリン酸架橋を開発することにより、ナノキトサン網目構造内に遷移金属と必須微量栄養素であるニッケルを組み込むことにより金属ナノ複合体を合成し、それを小麦の赤かび病の防除に応用した。 小麦の赤かび病の管理および病原性ストレス耐性能力による苗の活力の改善へのニッケルナノキトサン複合体の応用は、新しいアプローチである。 CNP と NiCNC の比較は、非結合キトサン ナノ粒子 (CNP) よりもフザリウム腐病の制御における金属ナノ複合体 (NiCNC) の促進効果を認識するのに役立ちます。 これに関連して、マンコゼブは、合成ナノキトサンおよびニッケル錯体ナノキトサンと市販の合成化学殺菌剤の有効性を比較するために使用されました。 したがって、私たちの研究から得られたデータは、バイオポリマーナノ複合体を介した他のさまざまな作物における赤かび病の防除対策を調査す​​るのに役立ちます。

主な観察として、CNP の形成は、乳白色の溶液と NiCNC ハイドロゲルの場合は黄オレンジ色の外観によって示されました。 UV-可視吸収分光法の結果は、CNP の特徴的な吸収ピークが 203 nm、NiCNC の UV 領域の 241 nm にあることを示しました。 CNP の高分解能透過電子顕微鏡 (HR-TEM) 分析では、サイズが 21 ～ 124 nm の範囲の微細な球形のナノ粒子 (ImageJ ソフトウェアで測定) であることが示されましたが、NiCNC の粒子サイズは 300 ～ 400 nm の範囲でした。 電界放射型走査型電子顕微鏡（FE-SEM）分析で明らかになったように、CNP と NiCNC は両方とも、互いに絡み合った粗い表面形態を持つ凝集体を示しました。 NiCNC は、ナノ粒子の高い結晶性の性質に似た尖ったエッジを持つナノディスクのような六角形のシート形態を示しました。 エネルギー分散型 X 線分光法 (EDXS) スペクトル分析により、NiCNC 中にニッケルが存在することが示され、NiCNC が金属共役ナノ粒子であることが確認されました。 CNP には必要な要素がすべて確認されました。 フーリエ変換赤外分光法 (FT-IR) スペクトル分析では、合成された CNP と NiCNC のピーク位置がほぼ異なることが示されました。 CNPとNiCNCの3302.56 cm−1と3173.68 cm−1のFT-IR吸収ピークは、それぞれ伸縮振動のO-HグループとN-Hグループに対応します。 1675.45および1628.22cm-1の吸収バンドは、それぞれCNPおよびNiCNCにおけるアミドIバンドの存在を示した。 1379.09 cm-1 で得られるピークは、平面曲げ振動における -C-O-H の存在、または NiCNC における -CH2 の揺れやねじれの存在を示しています。 1527.94 cm-1 の吸収バンドは、CNP には存在しない NiCNC の NH 曲げ振動 (アミド II) に似ています。 CNP の 1275.63 cm-1 で得られたピークは、P = O 伸縮振動の存在を示しています。 NiCNC の場合、400 ～ 600 cm-1 で得られるすべてのピークは、金属酸化物の振動の特徴的なピークです。 NiCNC で得られた 576.93 cm-1 の強いピークは、Ni-O 結合によって引き起こされる振動によるものです (図 1)。

(a) イオンチャネルゲル化法により得られた (a) CNP および (b) NiCNC のナノヒドロゲル画像。 （c）CNPとNiCNCのUV-VisスペクトルによるCNPとNiCNCの特性評価。 (d) CNP および (e) NiCNC の FE-SEM 分析。 (f) CNP および (g) NiCNC の HRTEM 分析。 (h) CNP および (i) NiCNC の粒度分布ヒストグラム。 (j) NiCNC および (k) CNP の EDXS 分析、および (l) CNP および (m) NiCNC の FT-IR 分析。

CNPとNiCNCの抗真菌活性は、異なる濃度の両ナノ粒子で処理したPDA培地で増殖させたF.ソラニのコロニー直径を測定することによって評価した。 7 日間のインキュベーション後、CNP と比較して、NiCNC はコロニー直径が小さくてもより効率的な結果を示したことが観察されました。 CNP および NiCNC の濃度が増加するにつれて、コロニーの直径は徐々に減少しました。 市販の殺菌剤 Mancozeb は、推奨用量で NiCNC に対して有意な活性を示さなかった (p ≤ 0.05)。 未処理プレートは 7 日間で完全なコロニー増殖を示しました (図 2)。 0.04 mg/mL の NiCNC では放射状成長の 100% 阻害が観察されましたが、0.04 mg/mL の CNP では 65.50% の成長阻害が示されました。 一方、マンコゼブは推奨用量で52.90の阻害率を示した。 0.04 mg/mL および 0.06 mg/mL の NiCl2 の抗真菌活性は、標的真菌に対して無効であることが判明しました。 NiCl2 の両方の濃度は、28% および 32% の菌糸体成長阻害を示しました。

F. solani の菌糸体の放射状成長に対する CNP と NiCNC の影響。 (a) PDA プレート上の CNP および NiCNC のさまざまな濃度 (0.001、0.01、0.02、0.03、および 0.04 mg/mL) による F. solani の菌糸体放射状成長。 (b) インキュベーション後 7 日目における、Mancozeb、NiCl2、およびコントロールと比較した、さまざまな濃度の CNP および NiCNC を含む F. solani のコロニー直径のグラフ表示。 （c）CNPおよびNiCNCの試験濃度下でのF.ソラニの放射成長阻害率（PIRG）を示すグラフ。 値は 3 回の反復の平均 (n = 3)、エラーバーは標準偏差 (SD) を示し、異なる文字 (a、b、c など) はダンカンの多重範囲検定による p ≤ 0.05 での治療間の有意差を示します。

ナノ粒子の抗真菌活性をさらに解明するために、胞子の発芽阻害率を調査しました。 処理の 6 時間後に光学顕微鏡で観察すると、未処理および CNP で処理した胞子と比較して、NiCNC 処理の場合には胞子発芽の顕著な減少が観察されました。 胞子を 0.04 mg/mL の NiCNC 溶液に曝露すると、胞子の発芽は 100% 阻害されましたが、Mancozeb の用量では、胞子発芽の阻害は 57.83% しか示されませんでした。 一方、F. solani 胞子に対する 0.04 mg/mL の CNP 処理は、胞子の発芽の 89% 阻害を示しました。 CNP および NiCNC の IC50 値は、それぞれ 0.021 および 0.019 mg/mL として得られました (図 3)。

F. solani の胞子発芽阻害率に対する CNP と NiCNC の影響。 （a）Mancozeb（16 mg/mL）および未処理（コントロール）胞子と比較した、さまざまな濃度（0.001〜0.04 mg/mL）のCNPおよびNiCNCによるF. solaniの胞子発芽阻害の顕微鏡画像（倍率= 400×） ; (b) F. solani の胞子の発芽阻害率。 データは平均 ± SD (n = 3) として表され、異なる文字は p ≤ 0.05 での治療間の有意差を示します。 (c) CNP および NiCNC の IC50 値。

F. solani の胞子形成抑制に対する 72 時間の異なる濃度の CNP および NiCNC の効果から、NiCNC による処理は濃度範囲の増加に伴って分生子形成の有意な減少を示すことが明らかになりました。 未処理プレートは 0.83 × 106 分生子/mL を示しましたが、NiCNC と CNP は 0.04 mg/mL 濃度でそれぞれ 0.02 × 106 および 0.05 × 106 分生子/mL の形成をもたらしました。 対照的に、Mancozeb の用量では 0.13 × 106 個の分生子/mL が生成されました (図 4)。

F. solani 胞子形成の抑制に対する試験濃度の CNP および NiCNC の影響。 (a) 光学顕微鏡下で観察された血球計算板上の胞子数。 （b）分生子形成に対するCNPおよびNiCNCの効果をマンコゼブおよび未処理（対照）胞子と比較したグラフ表示。 値は 3 回の反復の平均 (n = 3)、エラーバーは SD を示し、異なる文字 (a、b、c など) は p ≤ 0.05 での治療間の有意差を示します。

NiCNC で処理した胞子は、90% の生存率を示す未処理の胞子と比較して、0.04 mg/mL で 13 の生存率で生存率が低いことがわかりました。 CNPs 処理 (0.04 mg/mL) では、培地中の生存胞子の 28% が示されました。 Mancozeb (16 mg/mL) で培養した胞子は、56% の生存胞子を示しました (図 5a)。

F. solani の (a) 胞子生存率および (b) MDA 割合に対するさまざまな濃度の CNP および NiCNC の影響。 (c) NiCNC (0.04 mg/mL)、(d) CNPs (0.04 mg/mL)、(e) Mancozeb (16 mg/mL) の効果による F. solani の分生子および菌糸体における酸化ストレスの生成を示す蛍光顕微鏡観察mL）および（f）未処理の菌糸体。 (g) NiCNC (0.04 mg/mL)、(h) CNPs (0.04 mg/mL)、(i) Mancozeb (16 mg/mL)、および (j) 蒸留水に直接曝露した F. solani 分生子の形態変化。走査型電子顕微鏡。

使用した最高濃度の NiCNC では真菌内で 77.77% のマロンアルデヒド (MDA) が生成されますが、未処理の真菌の MDA は 0.00% です。 一方、CNPは、真菌を0.04 mg/mLの濃度で処理した場合、最大38.66％のMDAを生成します（図5b）。 逆に、マンコゼブ治療では 32.00% の MDA が示されました。

ナノ粒子適用の72時間後に真菌系で生成されたROSのレベルをDCFH染色法によって測定した。 図5c〜fは、未処理、NiCNC、CNP、およびMancozeb処理した真菌菌糸体で生成されたROSレベルに関連する蛍光顕微鏡で観察された画像を示しています。 我々の現在の研究は、NiCNC処理真菌菌糸体でより高い強度の蛍光が発生し、その後CNPとMancozeb処理が中程度の強度の蛍光を示すことを示しました。 未処理の真菌菌糸体では蛍光の発現は観察されませんでした。

合成されたナノ粒子を 72 時間適用すると、F. solani の分生子の形態が変化しました。 両方のナノ粒子は、分生子の形態に顕著な陥没を引き起こし、その結果、膜が完全に歪み、深刻な損傷が生じました。 未処理の真菌の分生子は、構造異常のないよく発達した均一な表面形態を示しました。 マンコゼブ処理により、未処理の分生子と比較して分生子表面にわずかな窪みが生じた。 それ以外の場合は、有意な差はありませんでした（図5g–j）。

20日目の終わりに、接種した苗の症状をSantori and Infantino (2009)の5段階スケールに基づいて分析した(表1)。 未処理の実生と比較して、NiCNC 処理した実生では病気の発生率の大幅な減少が観察されました。 未処理の苗は発病率が 93.33% で、苗の茎と根の部分が暗褐色に変色しました。 20日後には、感染後に生き残ることができなかった36.66%の枯れた植物もトレイ上で認められた。 しかし、NiCNC 処理した苗木はほぼ健康な活力を示し、感染率は 16.67% に過ぎませんでした。 CNPとマンコゼブの両方の処理は、苗木上でそれぞれ50％と53.33％という中程度の感染を示しました（図6a〜h）。

(a、b) 蒸留水 (未処理)、(c、d) CNP (0.04 mg/mL)、(e、f) NiCNC (0.04 mg) に曝露した、未接種および F. solani を接種した小麦苗の 20 日目の病気の症状。 /mL)および(g,h)マンコゼブ(16mg/mL); (i) 蒸留水処理し F. solani を接種した発病苗、および (j) NiCNC 処理し F. solani を接種した苗の茎の縦断面図。 感染性菌糸は、未処理の実生の組織内でのみ分岐することが観察されました。

苗における病気の発生率をさらに確認するために、未処理の病気の苗とNiCNC処理した接種土壌で育てた苗の両方の茎部分の解剖学的切片を実施した。 顕微鏡下では、発病した実生は褐色でクロロフィルの少ない腐った細胞を示し、感染ペグまたは付着器が顕著に発生しており、分化して一次感染性菌糸を形成し、さらに侵入性菌糸に発達することが観察された。 さらに、これらの細胞は細胞壁が完全に破壊されていた。 これとは対照的に、NiCNC 処理した苗木は、無傷の細胞壁を持つ新鮮な緑色で健康な細胞を示しました（図 6i-j）。

すべての処理の中で、NiCNC 処理を施した苗はより高い活力指数を示しました。 CNPs で処理した苗木では中程度の活力が観察されました。 マンコゼブ処理苗の場合、シュートと根の長さが短く、活力の低下が観察されました。 未処理の実生では正常な活力パターンが観察されました（図7a、b）。 苗の活力に対する病原性ストレスの緩和におけるCNPとNiCNC処理の効果を、草丈と根の長さのストレス耐性指数を通じて評価しました。 F. solani を接種し、さらに 0.04 mg/mL の NiCNC で処理した苗木は、最大の草丈と根の長さのストレス耐性指数を示しました。 CNPs で処理した接種苗は、草丈と根の長さにおいて中程度のストレス耐性指数を示しました。 Mancozeb で処理した接種苗は、適用した両方のナノ粒子よりも低いストレス耐性指数を示しました。 何も処理せずにF. solaniを接種した苗木は、すべての処理の中で病原性ストレスに対する耐性が最も低かった（図7c〜e）。

（a）蒸留水、CNP、NiCNCおよびマンコゼブで処理した20日目のF.ソラニを接種した小麦苗の形態的活力の観察。 (b) 変動処理した小麦苗の発病率。 （c）蒸留水（未処理）、CNP、NiCNCおよびマンコゼブで処理したF.ソラニ接種小麦苗の草丈および（d）根長ストレス耐性指数。 (e) 20日目の非接種小麦苗とF. solani接種小麦苗の活力指数。 値は 3 回の反復の平均 (n = 3)、エラーバーは SD を示し、異なる文字 (a、b、c など) は p ≤ 0.05 での治療間の有意差を示します。

哺乳類細胞株を一定範囲の漸増濃度 (0.01 ～ 0.4 mg/mL) の CNP および NiCNC に曝露し、各濃度での細胞毒性の割合を評価しました。 結果は、0.01 ～ 0.250 mg/mL のより低い濃度範囲では、両方のナノ粒子が播種された細胞に対して毒性効果を示さないという事実を明確に示しています。 細胞はナノ粒子の処理による影響を受けず、健全に再生しました。 したがって、両方のナノ粒子の存在下でも細胞生存率は変化しませんでした。 しかし、両方のナノ粒子の濃度が 0.3 mg/mL に増加すると、細胞は変化して陰性反応を示し、腎細胞の生殖不能を引き起こします。

環境および公衆衛生上の懸念に対する合成殺菌剤の悪影響を最小限に抑えることに関連して、キトサンなどの天然生物由来製品の使用が研究の世界でますます注目を集めています。 キトサンは、遷移金属や重金属と容易に錯体を形成できる強力なキレート剤とみなされています44。 さまざまな研究者が、金属イオンの隔離、染色、水処理、触媒作用、およびその他のさまざまな産業用途におけるキトサン金属錯体の応用に焦点を当ててきました。 しかし、二価イオン（Cu、Zn、Ni、Fe）を含むキトサン金属錯体は、-NH2 と -OH を持つキトサン分子の構造変化により、バルクキトサンや遊離金属塩よりも有望な抗病原体活性を与えることが報告されています。支配的な反応部位として。 キトサンおよびナノキトサンは、Alternaria solani、F. oxysporum、Aspergillus niger、Penicillium spp.、Candida spp.、Cordyceps militaris などの広範囲の真菌病原体を阻害することが知られています 46、47、48。

小麦の赤かび病と闘うためにニッケルキトサンナノ複合体を使用すると、病気の発生率が 83.33% 大幅に減少しました。 インビトロ試験では、0.04 mg/mL の NiCNC により、PDA プレート上の真菌コロニーの増殖が完全に停止したことが示されました。 NiCNC の濃度が徐々に増加すると、真菌コロニーの直径が減少することが観察されました。 これは、さまざまな著者によって示唆されているように、金属ナノ粒子の用量依存的な活性を裏付けています 49,50。 我々の結果は、NiCNC が F. solani に対して、Mancozeb の用量および試験された濃度の CNP よりも顕著な抗真菌効果を持っていたことを示唆しています。 マンコゼブは真菌の菌糸体の成長を 53% 減少させました。 これはジチオカーバメート系殺菌剤であり、殺菌剤耐性活動委員会 (FRAC) によって分類されており、複数部位に作用する51。 マンコゼブなどの合成殺菌剤は、哺乳類モデル生物に多くの機能不全を引き起こすことが報告されています52。 男性の生殖能力、胃腸の問題、喉のかゆみ、イライラ、くしゃみ、咳、気管支炎、経皮吸収に急性の影響を与えます53,54。 マンコゼブおよび他の同様の化学的殺菌剤の潜在的な毒性に関する情報は、農業分野、特に小麦のような世界中で消費されている主要な食用作物におけるその使用を支持すべきではありません。 東南アジアのさまざまな国で広く使用されていますが、欧州連合では 2021 年以降廃止されました55。 一方、0.04 mg/mL の CNP は 65.50% の増殖阻害を示し、NiCNC よりも有効な抗真菌剤ではないと結論付けられました。 さまざまな植物病原体に対する金属ナノ粒子またはキトサン-金属複合体の誘導効果は、さまざまな研究者によってより効率的であることがすでに記載されています56、57、58、59。 0.04 mg/mL および 0.06 mg/mL のバルク NiCl2 溶液の抗真菌活性は、F. solani の増殖に対して無力であることが判明しました。 0.06 mg/mL の NiCl2 というより高い濃度でも、標的病原体は顕著なコロニー増殖を伴って増殖します。 これは、NiCl2 をナノキトサンでパンチすると、前述の濃度で潜在的な抗真菌活性が付与されることを明確に示しています 60。 フザリウム属菌に対する銀キトサンナノ複合体の応用は 1 mg/mL で完全な阻害作用を示しましたが、我々の研究では、NiCNC は非常に低用量 (0.04 mg/mL) で F. solani の完全な阻害を示しました 28。 以前の研究を徹底的にレビューすると、Ni2+ イオンがキトサンに吸収されると、多くの植物病原体に対する抑制効果が強化されるという考えが強く裏付けられます 61。

NiCNC は、0.04 mg/mL で F. solani 胞子の発芽を阻害することに成功しました。 胞子は、宿主植物における病気の確立につながる、あらゆる真菌病原体の最小の増殖単位です62。 胞子の発芽は、病原体の栄養発達と生殖発達の両方にとって非常に重要です。 胞子の発芽は、非生物的ストレス、栄養ストレス、宿主と病原体のコミュニケーションに非常に敏感です63。 試験された最高濃度の NiCNC で胞子発芽プロセスが完全に停止することにより、NiCNC は F. solani に対する強力な殺胞子剤として定義されます。 得られた結果から、放射状コロニー成長の場合に見られたように、NiCNC が CNP や Mancozeb よりも強い抗真菌活性を示すことが明らかでした。

これまでの研究で、さまざまな研究者が抗真菌剤として金属および金属酸化物のナノ粒子の使用を推奨してきました64。 2012 年に Wani と Shah が行った研究 65 では、Fusarium oxysporum、Alternaria alternata、Rhizopus stolonifer などの病原体の胞子を酸化マグネシウムと酸化亜鉛のナノ粒子で処理すると、胞子の発芽が大幅に阻害されることが明らかになりました。 より具体的には、キトサンへの Ni2+ イオンの吸収は、Candida albicans の増殖阻害に大きく影響します 66。 NiCNC は、適切な胞子形成培地下で試験した最高濃度に曝露すると、明らかに分生子の形成を標的にすることができます。 キトサン金属複合体と菌糸の間の直接相互作用が細胞タンパク質の構造とその化学的性質を破壊し、その一部は分生子柄の形成に関与しているという仮説が立てられる可能性があります67。 さらに、私たちの実験の結果は、Ahmed et al. によって得られた結果と一致しています。 (2016)57 では、Ni ナノ粒子が 50 ppm でフザリウム種に対する殺胞子活性の大幅な上昇を示したことを明らかにしました。

XTT [2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニル-アミノ)カルボニル]-2H-水酸化テトラゾリウムの比色アッセイは、もともと栄養生殖能力を検証するために開発されました。カンジダ種、出芽酵母、ペニシリウム・クリオゲヌム、アスペルギルス・フミガタス、黒色アスペルギルス、トリコデルマ・アトロビリデなどのいくつかの臨床的に重要な真菌の生存率68。 場合によっては、菌糸とフィラメントの不均一な増殖により、真菌の最小発育阻止濃度の決定が困難になることがあります。 真菌増殖のこの比色定量化は、より正確かつ正確であることが知られています。 このアッセイは、真菌病原体の代謝活動を完全に阻害するために使用されることが知られており、その結果、胞子の発芽とその生存率が影響を受けます69,70。 NiCNC の投与量が増加すると、胞子の生存率が低下することが明らかに観察されました。 私たちの結果は、Ghasemian らによって得られた結果を強く裏付けています。 (2012) そこで彼らは、金属ナノ粒子が、特にフザリウム・ソラニの芽胞生存率を低下させるのに効果的であると言及しており、彼らによって実証されているように、60 mg/mL (最小発育阻止濃度) の銅ナノ粒子が殺胞子剤として効果的であることが判明した68。 ナノコンジュゲートの正電荷と負に帯電した真菌細胞成分間の静電相互作用が膜の不安定化と細胞の原形質漏出を引き起こし、その結果、生存不能な胞子が生じることが証明されている 38,71。

真菌の脂質過酸化に対する NiCNC および CNP の影響は、ナノ粒子の適用による細胞内ストレスの生成の結果として生成される MDA レベルを測定することによって評価されました。 真菌の膜に存在する多価不飽和脂肪酸にはメチレン (-CH2-) 基が含まれており、活性酸素種 (ROS) の生成によって悪影響を受け、脂質の過酸化を引き起こします。 この脂質過酸化現象は真菌膜の完全性を完全に破壊し、脂質過酸化の指標であるアルデヒド副産物 MDA を生成します。 生成されたこの MDA は、真菌 DNA に存在する 2'-デオキシグアノシン (M1G-dR) と反応して、プロパン付加物を形成します。 このプロセスは、細胞シグナル伝達、その成長と増殖、分化とアポトーシスを含む細胞のさまざまな生理学的機能に影響を与えることにより、真菌の代謝に大きな影響を与えます72。 本研究では、対照と比較して、NiCNC の濃度が上昇すると、真菌の MDA レベルが上昇することが判明しました。 MDA レベルの上昇は、真菌膜脂質との相互作用の結果として生成される ROS の悪影響によるものです。 私たちの研究は、CNP や Mancozeb と比較して、真菌細胞の完全性に対する NiCNC 処理の最大の悪影響を実証しました。

真菌の菌糸体と分生子で観察される蛍光の強度は、ナノ粒子への曝露によるストレスによって生成される ROS のレベルに直接比例します 73,74。 金属ナノ粒子がバルクの対応物よりも測定可能なほど多くの細胞内 ROS を生成できるという事実は、私たちの実験によって十分に結論付けることができます 75。 私たちの研究では、0.04 mg/mL の NiCNC が高強度の蛍光の発光により真菌の菌糸体と分生子に最大の酸化ストレスを生成するのに対し、CNP (0.04 mg/mL) と Mancozeb (16 mg/mL) は中程度の酸化ストレスを生成することが観察されています。蛍光の強さ。 NiCNC は、CNP や合成殺菌剤と比較して、真菌系において最大の酸化ストレスを生成する可能性があると明確に言えます。 金属ナノ粒子処理により生成される ROS は、真菌の膜の完全性と機能を完全に妨げ、増殖阻害や死滅を引き起こす可能性があります 72。 ある研究では、ROS レベルの増加により酸化剤と抗酸化剤のレベルがアンバランスになり、その結果、高い酸化ストレスが生じ、その後に細胞アポトーシスを引き起こすシトクロム C が放出されることが示されました 76。 F. oxysporum に対する金属のキトサンへの凝集は、我々の研究を強力に裏付ける高強度の蛍光を生成することが証明されています 38。

真菌の分生子に対する NiCNC と CNP の両方の処理は、膜透過性の増加を伴う破裂端や SEM で分析されたさまざまな表面異常など、分生子の膜に重度の不可逆的な損傷をもたらしました。 NiCNC を分生子に適用すると、原形質内容が失われ、その後細胞が漏洩し、分生子に穴が開いたように見えます。 この結果は、Dananjaya らによって得られた結果と完全に一致しました。 (2017) F. oxysporum に対する銀キトサン ナノ粒子の処理について、細胞壁の損傷と膜透過性の変化が観察されました。 金属酸化物ナノ粒子が病原性細菌の表面にドッキングできることが以前に確認されていた77。

in vivo 実験により、0.04 mg/mL の NiCNC が、発育中の小麦苗において F. solani の攻撃に対して最大限の保護を提供することが明らかになりました。 このキトサンと金属の複合体は、病気の発生率を 16.67% に減らすことができました。 この濃度は、小麦苗の腐敗病に対する抵抗性の誘導と考えられる。 研究者らは、キトサンとそのナノ粒子が、真菌の攻撃、より具体的にはフザリウム属 spp.78 に対する耐性誘発物質としての生物学的役割をすでに確立しています。 さまざまな報告は、キトサン自体が症状の重症度を低く示すことで植物の自然免疫を誘発するのに効果的であることを示唆しています79。 科学者らは、キトサンとそのナノ誘導体による処理により、発芽段階における実生の耐病性が大幅に向上する可能性があることを確認しました80。 さらに、ナノキトサンの金属複合体は、我々の研究の病気発生率の属性から評価されるように、病気耐性能力をさらに改善する可能性がある。

腐敗病の予防だけでなく、NiCNC による処理は苗の活力指数を効果的に刺激することができます。 NiCNC で処理した苗木は、合成殺菌剤、CNP、蒸留水で処理した苗木よりも背が高く、緑の健康な葉を持ち、根の長さが長くなります。 合成殺菌剤で処理された苗木は、草丈が低く根が小さいため成長が遅れ、活力指数が低いことが示されました。これは、苗木に対する殺菌剤の植物毒性を示す可能性があります。 これは、キトサンナノ粒子およびその誘導体の植物成長促進活性を裏付けるものである。 キトサンは、蒸散速度を低下させることによって植物のバイオマスを強化する植物成長調節剤であることが知られています。 最近、研究者は、キトサンベースのナノ粒子の植物成長促進活性のメカニズムに熱心に注目しています81,82。 キトサンナノ粒子は、窒素、カリウム、カルシウム、リン、マグネシウムなどの豊富な栄養素の摂取を通じて苗の成長を大幅に促進できることが証明されました83。 より正確には、キトサンとそのナノ誘導体は、IAAシグナル伝達経路の活性化を通じて発芽中の小麦苗の成長を促進すると結論付けることができます84,85。 私たちの研究から得られた結果は、以前の著者らの発見と一致しており、キトサンナノ粒子とその金属誘導体による処理は、生物ストレス曝露下での小麦苗の成長を積極的に促進できる可能性があることが示唆される可能性があります。 研究者らは、キトサンベースのナノ粒子による処理が植物の根と芽の長さの 1.5 倍の増加に寄与したと結論付けています 86。 この増加は私たちの研究で明らかであり、未処理のCNPおよびマンコゼブ処理苗と比較した場合、NiCNCでの処理後の植物の高さの増加を示しました（図7e）。

Ni2+ イオンは作物の栄養増殖に寄与することも知られており、その欠乏は栄養成長の低下、植物の老化の促進、窒素代謝の障害、萎黄病の発生、葉の矮小化、植物の構造の低下、および正常な鉄の取り込みの阻害を引き起こす可能性があります87。 。 植物へのニッケル曝露レベルが低いと、種子の発芽、クロロフィル合成、側根の形成が改善されます。 研究により、ニッケルが植物のフィトアレキシンの合成と耐病性の誘導に重要な役割を果たしていることが明らかになりました88。 導入部分で前述したように、Ni2+ イオンは、ウレアーゼ、一酸化炭素脱水素酵素などのさまざまな金属酵素の補因子として機能します。したがって、ニッケルが、人間の正常な機能のために低濃度で必要とされる必須微量栄養素であることは明らかです。植物に適用すると、ニッケルとキトサンの融合により生物活性が強化される可能性があります。 文献によると、作物が毒性を持たずに正常に成長し機能するためには、農作物が土壌 1 kg あたり平均 3 ～ 1000 mg の Ni を必要とします 89。 私たちの実験では、テストされた最高の生物活性濃度、つまり 0.04 mg/mL の NiCNC ハイドロゲル溶液には実際に 38% の Ni が含まれており (EDXS 分析による推定)、これは各苗木に適用される Ni のおよそ 0.00668 mg/mL に相当します。 実験は、30 本の苗木に対して 5 kg の土壌を入れたプラスチック製トレイで行われました。 各苗木には 5 mL の NiCNC 溶液を処理しました。したがって、30 本の苗木に対して 150 mL の NiCNC を 5 kg の土壌に適用しました。 さて、150 mL の NiCNC には、5 kg の土壌中に 1.002 mg/mL (0.00668 mg/mL × 150 mL) の Ni が含まれることになります (土壌 1 kg あたり 0.2 mg/mL Ni)。これは極めて低用量であり、毒性の可能性はありません。土壌中の金属の蓄積42。 したがって、合成されたニッケルキトサンナノ複合体は、環境に優しく無毒な抗真菌剤と考えられます43。

F. solani を接種した苗木のストレス耐性分析により、NiCNC の適用により草丈と根の長さが加速され、より大きな病原性ストレス耐性能力が誘導されることが明らかになりました。 植物の病原体感染によって引き起こされるストレスが草丈を引き起こし、根の増殖に影響を与え、成長の遅れを引き起こす可能性があることが知られています。 蒸留水で処理した苗木は病原性ストレスに耐えられず、植物が枯れてしまいました。 一方、CNPで処理した苗木は、NiCNC処理と比較して中程度のストレス耐性能力を示しました。 マンコゼブ処理された苗木は、CNP 処理に次いで病原性ストレスに対する耐性が低下しました。 私たちの研究は、合成殺菌剤の活性では腐敗病や病原体の侵入にうまく対抗できないことを示唆しています。 むしろ、合成殺菌剤の過剰使用は、植物、土壌、環境に毒性をもたらす可能性があります36。 この研究から得られた結果は、キトサン網目に挿入された金属 (Ni2+) イオンの促進効果を明確に示しています。 キトサンネットワークへのニッケルイオンの挿入の重要性は、小麦苗の成長促進活性を強化し、バルクキトサンよりも抗病原体活性を高めることである。

私たちの実験は、NiCNC が小麦苗中の腐敗病に対する病原体の悪影響を積極的に除去できることを強く示唆しています。 したがって、NiCNC の構造的立体配座は、その抗真菌活性に関して重要になります。 イオンチャネルゲル化法によるナノ粒子の形成は、有機溶媒を使用せず、加工条件が穏やかであるため、カプセル化された薬物の構造を少しでも変化させることができないという利点がある90。 UV-可視吸収分光法では、UV 領域の 241 nm で NiCNC の特徴的な吸収ピークが示されました。これは、以前のレポートで説明されているナノ粒子の形成によく似ています 91。 ナノ粒子の粒径が小さいほど、容易に浸透し、細胞取り込み能力が高いため有利です92,93。 NiCNC の粒子のサイズは 300 ～ 400 nm の範囲でした。 以前のいくつかの報告によると、真菌の細胞壁に容易に浸透するには、500 nm 未満の粒子サイズで十分です94、95、96、97。 研究者のグループは、図1f 98に示されているように、CNPがナノ凝集体の形で残っていることをすでに示唆しています。さらに、NiCNCのEDXS分析により、キトサンネットワーク内にNiが存在することが示され、静電相互作用による金属ナノ複合材料の形成が確認されました。キトサンの水酸基と関与する金属塩の間。 NiCNC のこの構造パターンは、さまざまな研究者による以前の研究ですでに確認されています99。 FE-SEM 分析により、CNP と NiCNC の両方の凝集が明らかになりました。 CNP のこの特定の基準により、大表面積の露出が促進され、吸着しやすい材料となることが可能になります 100。 同様に、NiCNC は均一に分布した高多孔質の凝集ナノ粒子を示しました。 これらの凝集またはナノクラスターの形成と NiCNC の多孔性により、NiCNC は優れた吸着特性を有する有用な生体分子となり、ナノ医療の分野でさまざまな応用が可能となります101。 FT-IR 分析では、抗真菌活性に積極的な役割を果たす必須の官能基の関与が示されました 102。

細胞毒性アッセイの結果は、未処理の対照と比較して、CNP および NiCNC の濃度を 0.25 mg/mL まで増加させても、有意な差は示されませんでした (図 8)。 どちらのナノ粒子も、0.3 mg/mL 以上で細胞毒性があることがわかりました。 細胞毒性のパーセンテージにおける有意差は、0.4 mg/mL で認められました。 NiCNC で認められる細胞毒性の割合の増加は、ナノ粒子内の金属イオンの関与によるものである可能性があります 38。 細胞毒性分析は、CNP および NiCNC が 0.25 mg/mL まで ACHN 細胞に対して無毒であることを示唆していますが、小麦苗に適用された F. solani に対する生理活性抗真菌薬の投与量測定は 0.04 mg/mL であり、毒性投与量よりもはるかに低かったです。 したがって、NiCNC の適用量は人間の細胞に対して無毒であり、小麦のような世界中で食べられている主要な食用作物の農業分野での使用を参考にすることができます。

哺乳動物ACHN細胞に対するCNPとNiCNCの細胞毒性の比較。 細胞毒性は、さまざまな濃度の CNP および NiCNC (0.01 ～ 0.4 mg/mL) による細胞毒性のパーセンテージに基づいて評価されました。 データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表されます。 アスタリスクマークは、CNP と NiCNC 処理の間で平均値が大きく異なる (p ≤ 0.05) ことを示します。

研究者らは、抗真菌活性を示すキトサンおよびその誘導体の作用機序を説明するためのさまざまな概念を啓発してきました。 彼らは、殺菌活性は正に帯電したキトサン分子と負に帯電した真菌細胞表面成分との相互作用によるものである可能性があり、それがイオンの不均衡に伴う膜透過性の増加につながると主張した103。 また、キトサンが真菌細胞に入ると、DNA の構造を変化させて DNA と相互作用し、mRNA とタンパク質の合成を阻害することも推奨されています 104。 さらに、キトサンは優れた金属結合能力を保持しており、微生物の増殖に不可欠な金属イオンをキレート化することが知られています。 ポリカチオン性キトサンのアミン基は、金属イオンの取り込みに関与しています105。 遷移金属イオンのニッケルは、キトサンの正に荷電したアミン基と中央に局在する四面体格子構造を形成すると考えられています106。 キトサン網目構造内のこのスーパーポジティブ金属コアは、病原性細胞内の電子輸送を遮断するニッケルイオンの溶解による抗真菌活性の促進に関与し、膜の不安定化、原形質漏出、その後の真菌の死滅を引き起こします107（図9）。

真菌性病原体に対するニッケルキトサンナノコンジュゲートの作用機構の概略図。

作物における赤カビ感染を制御するために使用される他のさまざまな管理戦略があります。 研究者は、腐敗病の発生率を 66 ～ 75% 減少させるトリコデルマ属、バチルス プルミレス、およびストレプトマイセスの特定の分離株などの生物防除剤を頻繁に使用してきました108,109。 これらの生物防除剤は害虫の数を減らしますが、完全に根絶するわけではなく、植物の成長を促進することもありません。 さらに、Azadirachta sp.、Zingiber sp.の抽出物などの必須植物の使用。 そしてマスタードベースの植物は、F. solani の菌糸体の成長を阻害する上でより高い効果を示しました110。 しかし、大規模な野外適用には、特に子嚢胞子に対して、安定性と長期間の抗真菌活性を備えた有望な製剤が必要です111。 この点において、ニッケルキトサンナノ複合体の使用は、苗の健康を高めて病気の軽減能力を高め、体外検査下で病原体を完全に根絶し、抗真菌活性を長期間保持できるため、有利です。 ただし、その広範な分野での応用についてはまだ研究が必要です。

CNP と NiCNC はイオンチャネルゲル化法によって合成に成功し、それらのさまざまな物理化学的特性に基づいて特性評価されました。 NiCNC の適用により、F. solani に対する潜在的な増殖阻害特性が示され、腐敗病の発生率が効率的に制御されました (特定の実験室条件下で)。 0.04 mg/mL の NiCNC 処理は、菌糸体コロニーの成長を完全に停止させ、胞子の発芽と分生子形成を阻害します。 NiCNC が真菌の分生子に曝露されると、超微細構造に損傷が生じ、その結果、生存不能な胞子が生じます。 NiCNC による処理により、病原体に高レベルの MDA が生成され、その結果真菌の脂質過酸化が増加します。 CNP と合成殺菌剤 Mancozeb を使用しても、腐敗病と効果的に戦うことはできません。 私たちのデータは、NiCNC が F. solani によって引き起こされる腐敗病の管理における抗真菌剤として使用できる可能性を示唆しています。 NiCNC 処理は病原体に高レベルの酸化ストレスを生成し、最終的に植物系での病原体の分岐を終結させました。 また、NiCNC を適用すると、生物ストレスにさらされても苗の活力指数が加速される可能性があります。 合成された複合体中のニッケル濃度は最小限であり、細胞毒性試験および健康な苗の活力を促進することにより、小麦苗に対して無毒であることが証明されました。 ただし、野外適用による小麦病原菌に対する NiCNC の影響を調査するには、さらなる研究が必要です。

CNP の調製は、イオントロピックゲル化法 38 に従って実行されました。 簡単に説明すると、0.2 g の低分子量キトサン (50,000 ～ 190,000 Da; 80% N-脱アセチル化; 製品 448,869; Sigma Aldrich, USA) を 1% (v/v) 酢酸溶液に溶解し、連続撹拌下で 30 分間放置しました。 。 陰イオン塩、トリポリリン酸ナトリウム (STPP) (Na5P3O10; HSN コード: 28,353,100; SRL、インド) を 1 mg/mL (40 mL) の濃度で、一定の磁気撹拌下でキトサン溶液に滴下添加しました (REMI Equipments) 。 濁った懸濁液が自然に形成され、結果的にNPが形成され、10,000 rpmでの遠心分離にかけた。 上清を廃棄し、CNPs ゲルのペレットを天日乾燥し、さらに使用するために 4 \(^\circ\)C で保存しました。

NiCNC は、Helen & Rani (2016) によって記載されている方法に若干の変更を加えて次の方法で調製されました 43。 その合成は、キトサン溶液に一定の磁気撹拌下で塩化ニッケルの４％水溶液（ＮｉＣｌ ２ ・６Ｈ ２ Ｏ；ＲＭ７６０；Ｈｉｍｅｄｉａ、インド）を滴下することによって行われた。 溶液を１２０℃で１５分間還流した。 これに、０．０５Ｍアスコルビン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６；ＭＷ１７６．１２；ＣＭＳ１０１４；インド、ハイメディア）を添加し、続いて２ｍＬの０．６Ｍ ＮａＯＨを添加した。 さらに３０分間撹拌した後、０．５ｍＬのフェニルヒドラジン（Ｃ６Ｈ６Ｎ２Ｃｌ２・ＨＣｌ；ＲＭ９４４８；インド、ハイメディア）を溶液に加えた。 反応は、一定の撹拌下でSTPPを滴下し、続いて10,000rpmで10分間遠心分離することによってさらに実施した。 上清を捨て、ペレットをゲルとして得た。

CNP および NiCNC の UV-Vis スペクトル吸光度は、スキャン範囲 200-800 nm の波長の UV-Vis 分光光度計 (Aligent Technologies、Carry 100 UV-Vis) を使用して収集されました。 CNP と NiCNC の形態は、JEOL JEM 2100F で倍率 50x ～ 1.5Mx、加速電位 200 kV で実行された HR-TEM によって検査されました。 ナノ粒子の表面トポグラフィーは、JSM-7900F ショットキー電界放射型走査電子顕微鏡 (FE-SEM) によって検査されました。 日本電子、0.1 ～ 30 kV。 特に NiCNC の場合、ホウ素に至るまでの元素の存在も EDXS を使用して測定されました。 ナノ粒子に存在する官能基は、KBr ペレット技術を使用した 500 ～ 4000 cm-1 のスキャン範囲内の FT-IR 分析によって検出されました。 FT-IR 分析を実行する前に、ナノ粒子を天日乾燥し、乳鉢乳棒を使用して微粉末に粉砕しました。 分析中に、300 mg の乾燥 KBr を粉砕し、2 mg の事前に乾燥させたナノ粒子と混合し、グリースを含まないサンプル カップに入れました。 KBr とナノ粒子の均質な混合物が調製され、サンプルのスペクトル分析に使用されました。

標的病原体を分離するために、インドの北ベンガル州の小麦栽培圃場から、コムギの茎腐れと足腐れの典型的な症状を有する発病した苗木を収集した。 病気になった植物の部分を収集するために農家から許可を得ました。 約１ｃｍの病気の茎を切除し、表面を滅菌し、２０ｍＬのオートクレーブ処理したポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）培地を含む滅菌ペトリ皿に置いた。 プレートを28 \(^\circ\)Cで7日間インキュベートします。 7日後、分離株を数回継代培養して、純粋培養のプレートを得た。 純粋培養物は同定のために IARI (インド農業研究所、ニューデリー、インド) に送られ、病原体は Fusarium solani (ID No. 11116.19) であると報告されました。 純粋培養物は、実験でさらに使用するために、PDA スラント内で 28 \(^\circ\)C で維持されました 112。

F. solani の菌糸体の放射状成長に対する CNP と NiCNC の抗真菌活性は、毒入り食品技術によって測定されました 38。 一定範囲の濃度 (0.001、0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL) の CNP および NiCNC を、オートクレーブ処理したポテト デキストロース寒天 (PDA) 培地 20 mL と混合しました。 直径５ｍｍの菌糸体ディスクを、鋭利な滅菌コルクボーラーを使用して、ＰＤＡ培地上で増殖させた７日齢のＦ．ソラニの胞子形成培養物から切り出し、各処理プレートの中心に播種した。 各治療プレートは 3 つのレプリカから作成されました。 市販の殺菌剤である Mancozeb を市販の推奨用量 (16 mg/mL)113 で処理したプレートと、何も処理しなかったプレートを、すべての処理間の比較のために準備しました。 プレートを 28 \(^\circ\)C で 7 日間インキュベートしました。 真菌コロニーの放射状の増殖を、最も速く増殖するコロニーがプレートの全直径を覆うまで毎日監視した。 真菌の増殖の阻害は次の式を使用して計算され、放射状増殖の阻害パーセント (PIRG) として表されます 38:

胞子発芽阻害に対するCNPとNiCNCの活性を凹面スライド法により評価した。 分生子懸濁液は、10 mLの滅菌蒸留水を7日間の胞子形成培養管に注ぎ、穏やかに振盪し、続いて懸濁液をチーズクロスで濾過することによって作製した。 次に、150 μL の分生子懸濁液を、前の実験で使用したのと同じ量の異なる濃度の CNP および NiCNC と混合しました。 同様のセットアップを 16 mg/mL の Mancozeb を使用して調製しました。 約 1.0 × 106 分生子/mL を含むハイブリッド約 60 μL をスライド上に置き、湿潤チャンバー内で 28 \(^\circ\)C で 6 時間インキュベートしました。 6時間後、分生子を光学顕微鏡(Magnus、ch-20i、Olympus)で検査した。 発芽した胞子の総数は、顕微鏡下でスライドのランダムに選択された 6 つの領域に存在する総胞子から数えられました。 胞子の発芽阻害%は、次の式を使用して計算されました112:

胞子形成抑制に対するCNPおよびNiCNCの効果は、適切な胞子形成誘導培地、つまりCzapek Dox寒天培地を使用し、CNPおよびNiCNC溶液と混合して最終濃度0.001、0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mLを得ることによって調べた。 濃度をブランクとマンコゼブと比較しました。 完全に滅菌した後、ハイブリッド 4 mL をペトリ皿に注ぎ、放冷しました。 次いで、直径約０．５ｃｍの真菌接種材料を無菌的に処理培地に移した。 プレートを28 \(^\circ\)Cで72時間インキュベートしました。 各処理の胞子密度は、光学顕微鏡下で血球計を使用して測定されました71。

生存胞子の定量的評価のために、XTT 2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニル-アミノ)カルボニル]-2H-水酸化テトラゾリウムを使用して比色アッセイを実行しました。 (TC239、ハイメディア、インド)。 このアッセイには、電子結合剤メナジオン (CAS No. 58-27-5、Sigma Aldrich、米国) も含まれます。 簡単に説明すると、胞子懸濁液 (1.0 × 106 分生子/mL) を Czapeck 液体培地で調製し、懸濁液 100 μL を 96 ウェル平底マイクロプレートで 28 \(^\circ\)C で 4 時間培養しました。 インキュベーション後、異なる濃度範囲 (0.001、0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL) の両方のナノ粒子 100 μL を懸濁液に添加し、再度同じ温度でさらに 4 時間インキュベートしました。 400μgの濃度の50μLのXTT溶液を7μLのメナジオン(25μM)とともに懸濁液に添加した。 マイクロプレートを 28 \(^\circ\)C で 3 時間インキュベートし、光学密度を 450 nm で測定しました114。

真菌の脂質過酸化に対するCNPおよびNiCNCの前述の濃度の影響は、脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒド(MDA)の定量的評価によって決定された。 ナノ粒子で処理した菌糸体マットは、28 \(^\circ\)C で 7 日間インキュベートした後に回収されました。 菌糸マットを滅菌蒸留水で十分に洗浄し、その後、吸い取り紙を使用して乾燥させた。 ２ｇの菌糸体を、予め冷却した乳鉢および乳棒中で、１０ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて冷却均質化した。 このホモジネートを 10,000 rpm で 12 分間冷却遠心分離しました。 無細胞上清を MDA の推定に使用しました。 ホモジネート 100 μL を、10% (w/v) トリクロロ酢酸 (Himedia、インド) を含む 0.335% (w/v) チオバルビツール酸 (Himedia、インド) 溶液 3 mL と混合しました。 混合物を沸騰水浴に１５分間さらした。 MDA レベルは分光光度計 169 (Sytronics) で測定し、530 nm でのモル吸光係数 1.56 × 105 で計算しました115。

酸化ストレスアッセイは、CNP および NiCNC 処理の効果として真菌の菌糸で生成される ROS のレベルを検出するために実行されました。 この実験では、典型的な細胞透過性、非極性、非蛍光プローブ分子である 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (H2DCFH-DA) (D6665; Sigma Aldrich, USA) を使用しました。 この疎水性分子は細胞内に入ると、細胞内エステラーゼによって脱アセチル化されて 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン (DCFH) になります。 DCFHは、ナノ粒子への曝露によるストレス発生の結果として細胞内で生成されるROSによって酸化されます。 DCFH は、励起時に検出可能な緑色蛍光を発するジクロロフルオレセイン (DCF) に変換されます。 真菌の菌糸を、CNP と 0.04 mg/mL および 16 mg/mL の Mancozeb での NiCNC 処理を含むポテト デキストロース ブロス (PDB) 中で 28 \(^\circ\)C で 72 時間培養しました。 72時間後、10,000rpmで10分間の遠心分離によって菌糸を収集した。 培地を上清とともに廃棄した。 菌糸細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、菌糸を同じ中に懸濁させたままにした。 菌糸懸濁液を暗室で 40 μL の H2DCFH-DA と混合しました。 処理物を暗所、28 \(^\circ\)C で定期的に振盪しながら 2 時間インキュベートしました。 最後に、ROS の生成を、485 nm の励起フィルターと 525 nm の発光フィルターを備えた蛍光顕微鏡 (Nikon Eclipse E200、Nikon、東京、日本) で視覚的に観察しました。

0.04 mg/mL での CNP および NiCNC 処理、および 16 mg/mL での Mancozeb 処理の結果としての真菌胞子の形態学的変化を走査型電子顕微鏡 (SEM) (JSM-IT 100; JEOL) で観察しました。 PDB 内の真菌の胞子をナノ粒子で処理し、72 時間インキュベートしました。 真菌の分生子は顕微鏡検査の前に前処理を受けました116。

腐敗病の発生率を減少させるCNPとNiCNCの能力を評価するために、試験が実施されました。 National Seed Corporation of India Ltd.から収集したパン小麦（Triticum aestivum L.）品種（PBW 343）を実験に使用した。 すべての植物実験は、関連する制度的、国内的、国際的なガイドラインおよび法律に従って行われました。 分離された F. solani を、発育中の実生における茎腐れおよび足腐れの症状を得るために、実生への人工接種のための接種材料として使用した。 接種材料の濃度は106分生子/mLであった。 病原体の人工接種は根照射法により行った。 簡単に言うと、5 mLの分生子懸濁液を生後4日の苗の茎の基部の周囲に注ぎました。 接種の２４時間後、上記と同じ手順に従って、同量の０．０４ｍｇ／ｍＬのＣＮＰおよびＮｉＣＮＣを適用した。 苗木は、バーミキュライトと1:1の比率で混合した5 kgの土壌を含むプラスチックトレイ(14 × 30 × 7 cm)で育てました。 処理は次のように分類されました:未処理、CNPs (0.04 mg/mL)、NiCNC (0.04 mg/mL)、および Mancozeb (16 mg/mL) で処理された苗木。 各治療を再び F. solani を接種したセットと接種しなかったセットに分けました。 各セットについて、30 本の苗をトレイに等間隔で播種しました。 実験は 20 日間プログラムされ、定期的に水やりが行われました。 20 日間の完了後、Santori and Infantino (2009) が提案した 5 段階スケールに基づいて、F. solani によって引き起こされる腐敗の症状を各植物について記録しました117: 0 = 症状なし。 1 = 根元または足の付け根がわずかに暗褐色になっている。 2 = 茎または根のほぼ半分が暗褐色に変色している​​。 3 = 茎または根が完全に暗褐色。 4 = 植物全体が枯れる。 収集されたデータは、疾患指数の評価のためにマッキニー式 (1923) に組み込まれました 118。

ここで、Fk = 処理区内の感染苗の数（5 段階スケールによる）。 n は評価された苗の総数に等しくなります (n = 30)。 xk は、対照セットアップからの感染した実生の総数に等しい。

実生の発病率も実験から評価した119。

処理された苗の形態学的活力は、次の活力指数式120を使用して分析されました。

処理された苗のストレス指数を計算して、苗の活力に対する病原性ストレスの緩和におけるCNPとNiCNC処理の効果を評価しました121。

ヒト腎臓細胞株 (ACHN) は、インドのプネーにある国立細胞科学センター (NCCS) から入手しました。 細胞毒性は、MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) アッセイを使用して検査されました122,123。 急速に増殖するヒト腎臓細胞株を、DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地) Ham F-12 細胞培養培地中、5% CO2 存在下、37 °C で 6 × 103 細胞/個の密度で 96 ウェルマイクロタイタープレートに播種しました。良い。 24 時間後、細胞がかなりの集密度に達したとき、CNP および NiCNC ナノ粒子を 0.01 ～ 0.4 mg/mL の範囲の異なる濃度で 3 回ずつ各ウェルに添加しました。 処理したプレートを同じ条件下でさらに 24 時間インキュベートしました。 翌日、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養培地を吸引した。 1X PBS に溶解した MTT 10 μL を各ウェルに添加し、プレートを再度上記の条件で 3 時間保持しました。 最後に、50μlのイソプロパノールをMTT溶液を含む各ウェルに加え、約10分間振盪した。 吸光度はELISAリーダーで620nmで記録されました。

細胞毒性のパーセンテージは、[(C−T)/C × 100] として計算されました。ここで、「C」はコントロール (未処理細胞) の平均光学密度、「T」はさまざまな濃度で処理された細胞の平均光学密度です。ナノ粒子の。

実行された実験から得られたすべてのデータは、標準偏差 (SD) を含む 6 つの異なる観察値の平均として表されました (平均 ± SD)。 統計的差異は、ダンカンの多重範囲検定 (DMRT) を使用して p ≤ 0.05 (DSAASTAT ver. 1.022) で分析され、有意に異なる処理は文字 a、b、c などで示されました。および未接種の苗木は、対応のない両側 t 検定を使用して実行され、GraphPad Prism ソフトウェア ver. を使用して異なる処理間の有意差を見つけました。 Windows の場合は 6 (GraphPad Software, Inc. USA)、p < 0.05。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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筆頭著者が UGC-NET JRF フェローシップを受賞したため、基礎研究支援を提供してくださった大学助成委員会 (インド政府) に著者らは感謝の意を表します。 著者らはまた、National Seeds Corp. Ltd.、SAIF-IIT Bombay、CIF-LPU (インド)、および動物学部 (北ベンガル大学、インド) の協力に感謝します。

パラッシュ・マンダル氏が亡くなった。

ナノ生物学および植物療法研究所、植物学部、北ベンガル大学、ダージリン、WB、734013、インド

ディヴィヤ・チョーハン & パラッシュ・マンダル

ANMOL Laboratory、生物工学部、北ベンガル大学、ダージリン、WB、734013、インド

アンキタ・ダッタ & アヌープ・クマール

植物学部、北ベンガル聖ザビエル大学、Jalpaiguri、WB、735134、インド

チャンドラニ・チョードリー

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DC - 方法論、検証、形式分析、データキュレーション、執筆 - オリジナルドラフト、視覚化。 AD - 細胞毒性分析: 方法論と検証。 AK - 細胞毒性分析: 概念化と監督。 PM—概念化、監督、プロジェクト管理者、執筆編集。 CM - 構想、監督、プロジェクト管理者。 図 1、2、3、4、5、6、7 および 9 は、AD によって作成された図 8 を除き、DC によって作成されました。すべての著者が原稿をレビューしました。

チャンドラニ・チョードリーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Chouhan, D.、Dutta, A.、Kumar, A. 他。 小麦のフザリウム腐病と闘うための抗真菌剤としてのニッケルキトサンナノ複合体の応用。 Sci Rep 12、14518 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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受信日: 2022 年 3 月 23 日

受理日: 2022 年 8 月 17 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18670-2

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